从法医相关性昆虫体内提取人类DNA的研究进展 做DNA好还是法医好

【摘要】本文从嗜血性昆虫、嗜尸性昆虫、嗜骨性昆虫及实验技术等多角度阐述了从法医相关性昆虫嗉囔中提取人类DNA的可
行性及国际研究和应用进展。
【关键词】法医昆虫学；
嗉囔；
个体识别；
DNA
【中图分类号】D919．1
【文献标识码】B
【文章编号】1007—9297(2005)04—0308～04
随着分子生物学技术的发展，DNA在刑事案件及
民事案件中发挥了巨大的作用。对于死亡重罪中的个
体识别及将罪犯与现场的关联方面．DNA技术屡建奇
功。而在亲子鉴定，打击拐卖人口方面，DNA技术也展
现了其非凡的魅力。目前较常见有从现场血痕、毛发、
牙齿、香烟过滤嘴及搔抓当事人时指甲缝中的残留物
中提取扩增DNA。同时，作为新兴学科，法医昆虫学在
人类DNA的提取扩增中逐渐得以应用。
法医昆虫学是介于法医学和昆虫学的交叉学科，
主要用于刑事案件中被害人死亡时间的推断(PMI)。
【作者简介】万香波(1980- )~J，河南西峡人，中山大学基础医学院法医病理研究生。Tel：+86—20-33080271，E-mail：Wan1712@eyou．com
[通信作者】王江峰，法医病理博士后，副教授；
研究方向：法医昆虫学。
[基金项目】国家自然科学基金项目“基于嘈尸性昆虫的死亡时间推断”(基金编号：30100216)；
广东省自然科学基金项目(基金编号：001386)
法律与医学杂志2005年第12卷(第4期)
目前法医昆虫学方法已被认为是腐败尸体死亡时间
推断最有效的方法。除此之外，法医昆虫学亦可用于
死亡地点、死者中毒情况甚至死者身份的判别。日常
临案工作常见的为嗜尸性、嗜血性昆虫。由于其在现
场取食尸体组织，叮吸当事人的血液，因而扩增其胃
肠道(即嗉囔)中未消化的人的DNA、线粒体DNA，则
可望成为谋杀、强奸等案件以及用于死亡时间推断的
昆虫是否与被害人尸体相关中个体识别的直接证据。
嗉囔作为昆虫的食物储存器官而非消化器官。故而没
有蛋白水解酶的分泌。虽然昆虫在吞噬食物时其唾液
中有少量蛋白酶，但这种预消化对宿主DNA的降解
很少。故而对嗉囔内容物中的宿主DNA进行提取、扩
增则成为个人识别的理想底物。
一
、法医相关性昆虫
(一)嗜血性昆虫
临案工作中常见的嗜血性昆虫为虱和蚊。由于其
常常从一宿主转移至另一宿主，因而使之成为强奸、
谋杀等案件中当事人曾在案发现场的有力证据。
法医临案中常见的蚊为按蚊(Diptera：Culicidae)，最
初常用免疫学方法通过对血型的检验进行个体识别
的粗筛以及确定被蚊吸食的脊椎动物的种系。[1,21随后
的研究发现，用PCR方法从按蚊(Diptera：Culicidae)的
嗉囔(blood mea1)中扩增宿主DNA，其吸食血液后的
消化时间在0，8，16，24，32h时与宿主DNA的成功扩
增率在逻辑回归曲线上呈明显的负相关，且宿主DNA
扩增的成功率在吸食后12—24 h时下降得最快(P=
0．001)。但通过对扩增的TC一11、VWA两段短串联重
复序列(STR)的观察发现，在上述任一时点嗉囔内血
量的多少对两位点的成功扩增影响不大，且在同一时
点，两位点扩增的成功率几乎相等(P=0．85)。此外，周
围环境对蚊的消化速率影响较大，32cc时的消化速率
为22cI=时的两倍。通过在实验室温度为27℃、吸食血
液后最长32 h时仍可扩增出宿主DNA的事实，可知
在温度升高或降低时其成功扩增的极限时间亦随之
缩短或延长。[31由此可见，由于分子生物学中PCR技
术的成熟，使微量DNA的成功扩增成为可能。因而从
蚊的嗉囔中提取扩增宿主DNA时，影响扩增成功与否
的主要因素是吸食后的消化时间而非嗉囔内血量的
多少。
寄生于人身上的虱分为体虱与头虱。Replogle等网
最早于1994年从17只阴虱的排泄物中通过AMP—
FLP技术获得了人类特异性基因座D1S180及
HUMTHO1，其与阴虱所寄生的宿主相一致，但是Re—
plogle并未扩增出完整的DNA。Lord等[51在1999年
成功地从阴虱Pthirus Pubis(L)中分离、扩增出宿主的
线粒体DNA(mtDNA)。人类线粒体DNA(mtDNA)位于
核染色体外，具有组织特异性，为共价闭合的环状双链
DNA分子。没有重组、倒置、易位等突变现象，具有较
高的保守性，组成也相当稳定，严格遵守母系遗传。人
类线粒体DNA大小为16．5Kb，包括2s rRNA、22s
tRNA及13个编码特定功能多肽的基因。[6,71每一个体
细胞内核DNA仅有两个拷贝，而线粒体DNA却有上
千个拷贝。因而在细胞的量较少或是检材高度降解，难
以对核DNA成功扩增时，对线粒体DNA进行扩增，结
果则较为理想。目前此技术已广泛地应用于人的毛
发、骨、牙齿等的检验。【蝴由于体虱常从一宿主转移至
另一宿主，Mumcuoglu等【 从2只体虱中成功扩增出
与其所寄生宿主相符的混合DNA，体虱在吸食血液后
的20h内，用于个体识别的基因座D16S539、D7S820、
D13S317均可同时扩增。值得注意的是，欲从虱消化道
中提取宿主DNA至少需要2只体虱或是6只头虱。
这是因为头虱体型较小，每次吸食的血量亦较少，但是
其消化速率却较体虱要快。另外欲成功提取宿主
DNA，须用消毒棉签将虱捣碎，否则无法进行PCR扩
增。且因提取物较少，故为保证成功扩增，至少需要35
个循环。显而易见，虱由于其活动范围局限，仅在密切
接触时才从一宿主转至另一宿主，因而在诸如强奸等
案件中，若能从中提取并用PCR扩增出当事人双方的
DNA或线粒体DNA，则可为庭审提供最有力的证据。
但其最大的局限性在于其时效性——若吸食的血液
已被完全消化，则无法进行PCR扩增，此时可尝试用
AMP-FLP技术对虱排泄物进行分析，以寻找相关的基
因信息。
(二)嗜尸性昆虫
在法医检案中常常遇到这样的情形：现场除蝇蛆
外无其他阳性发现，而蝇蛆是该处曾发生动物体腐烂
的直接证据。若能从蝇蛆嗉囔中提取出宿主DNA，则
可有力地证明现场移尸的推断。同理，通过尸体上滋生
的嗜尸性昆虫可对高度腐败的尸体进行死亡时间推
断(PMI)。[11 141若可从其嗉囔中获得宿主DNA，即可证
明其与尸体的依存关系，而非暂时寄生或路过。此时即
可通过嗜尸性昆虫的发展演替规律进行准确的死亡
时间推断。
Richard Zehner等[151通过对10具尸体上的丽蝇
(Diptera，ealliphoridae)、2具尸体上的麻蝇(Diptera，
Sareophagidae)、1具尸体上的家蝇(Diptera，Muscidae)
· 310 ·
的研究发现。除未能从其中4具尸体上附着的蝇蛆嗉
囔中获得STR外。其余9具尸体上附着的蝇蛆嗉囔中
均获得与寄生宿主一致的STR(其中7具尸体上蝇蛆
嗉囔中的STR较完整，其余2具的不完整。其中一具
已死亡4个月．由于所处其温度较低使得DNA的降
解速率减慢。故而亦成功地扩增出完整的宿主DNA)。
考虑到现场尸体在滋生寄生昆虫时均已有不同程度
的腐败。DNA的降解亦随之发生。鉴于核DNA与线粒
体DNA在体细胞内拷贝数的巨大差异。当无法提取
扩增出核DNA时。运用PCR技术扩增线粒体DNA。
其结果相对较为理想。上述4例未成功扩增出核DNA
的，随后在对线粒体DNA的高变区(HV I，HVⅡ)进
行扩增时均获成功。大量研究证明：蝇蛆的种类对
STR分型的结果无影响。某些类似Sarcophagidae的麻
蝇在其幼虫发育的最后阶段会噬食其他蝇蛆的幼虫。
此时未被后者消化的宿主DNA则随之进入前者的嗉
囔内。此时仍可从前者的嗉囔中成功获得后者所寄生
宿主的STR。在某些特殊情况下需确定嗜尸性昆虫所
寄生的宿主的种系(如猪、牛、人等)时，可分析确定其
Cytochrome b的基因序列．而后对比基因库中何种与
此序列相符，即可确定。
(三)嗜骨性昆虫
在尸体腐败的后期，软组织因腐败而逐渐软化、
液化直至完全溶解消失，最后仅剩下骨骼(即白骨
化)。在白骨化时先前寄生于尸体上的蝇蛆大部分已
迁徙他处，现场仅留下少数的嗜骨性甲虫。法医检案
中常见的是露尾甲幼虫Omosita spp(Coleoptera：Ni．
tidulidae)。由于白骨化时骨中的核DNA大部已降解
完毕，因而线粒体DNA则成为宿主识别的重要标
志。Dizinno等D6]从在野外已暴露数月的人肋骨上获
得露尾甲幼虫Omosita spp(Coleoptera：Nitidulidae)。
而后成功地运用PCR技术获得了与死者母亲相符
的线粒体DNA，从而确认了死者的身份。由此可见
在尸体达到白骨化时，在无其他方法证明尸体身份
时，通过嗜骨性甲虫嗉囔内容物则可进行死者个体
识别。
二、实验技术对结果的影响
从现场采集的昆虫标本。为防止其嗉囔中DNA
成分的进一步降解，需立即处理。传统的保存方法是
采用福尔马林、酒精等保存液。Linville等【·2】观察了
70％酒精、95％酒精、Kahle氏液、福尔马林、一70cI=、
4cI=、24cI=等7种保存方法对线粒体DNA及STR分型
的影响。结果显示：福尔马林保存DNA的效果最差．
法律与医学杂志2005年第12卷(第4期)
70％酒精、95％酒精的效果较好。即使经过6个月。提
取DNA进行线粒体DNA及STR分析的成功率仍较
高。且温度对其影响不大，4cI=与24cI=时，在70％酒精
中保存的效果相当。在Kahle氏液中存放两周的标本
只能进行线粒体DNA的序列分析而无法进行核
DNA的STR分析，8周时则二者均不可。4cI=及24cI=
且无保存液时。二者效果与酒精相当。一70cI=时即使经
过6个月．线粒体DNA及核DNA的sTR分析的成
功率与现场采集的新鲜标本相同(因为低温降低了消
化酶的活性，使降解停止，且低温使细菌无法存活)。
值得注意的是，一系列的实验表明，欲成功地进行
PCR扩增。从嗉囔中提取的DNA的极限浓度为0．06
ng／txl。
在从嗉囔中提取宿主DNA时，应将嗜尸性昆虫及
蚊的嗉囔从其体内取出，而后将之捣碎，但捣碎之前最
好先将之置于一70cI=环境中。一方面，使之取出后易于
捣碎：另一方面，使之被捣碎时对DNA双链连续性的
破坏较小。从而易于进行PCR扩增。
三、结束语
由于分子生物学技术的发展，使得微量分析成为
可能。从案发现场常见的昆虫之嗉囔中提取扩增宿主
核DNA、线粒体DNA，依据STR分型、限制性片段长
度分析进行个体识别具有良好的应用前景．此方面有
待于进一步的深入研究。
参考文献
【l】 Weitz B．Identification of blood meal of blood-sucking arthropods叨．
Bull World health Org，1956，15：473-490
[2】 Boreham PFL。Some application of blood meal identification in relation
to the eoidemiology of vector-borne tropical disease [J】．J Tmp
Med Hygiene，1975，78：83-91
[3】Mukabana WR，Takken Seda et a1．Extent of digestion afects
the success of amplifying human DNA from blood meal of Anopheles
gambiae(Diptera：Culicidae)[J】。Bulletin Entomological Research，
2002，92：233-239
[4】Jef Replogle，Lord WD，et al。Identification of host DNA by amplified
Fragment Lensth Polymorphism Analysis：
Preliminary analysis
of Human Crab Louse(Anophura：Pediculidae)Excretal[J】．J Med Entomol，
1994，3 1(5)：686-690
[5】Lord WD，DiZinno JA，Wilson MR．et a1．Isolation， amplification，and
sequencing of human mi tochondrial DNA Obtained from Human
Crab Louse，Pthirus Pubis(L)，blod meal[J]。J Forensic Sci，1998，43
(5)：1097-1 100
[6】Wilson MR，Stoneking M，Holland MM，et a1．Guideline for the use of
mitochondrlal DNA sequencing in forensic science 叨．Crime Lab
Digest，1993，20(4)：68-77
[7】Anderson S，Bankier AT，Barrell BG,et al。Sequence and organiza—
f下转第304页)
改变，CT值亦无降低。直至24 h才形成明确的梗死
灶。文献报道，在CT扫描断层层面为10mm的病例中
常出现假阴性，而当层面改为3—4mm时，这种假阴性
可基本消除。[91本实验扫描层厚为5 mm，显著降低了
假阴性率。
Dzialowski等[10】认为：两侧脑组织的CT值的差
值<4HU，则肉眼难以辨别出梗死灶。而本实验中3 h
组．5只动物两侧大脑半球的CT值差值分别为：①
3．66 HU、②3．49 HU、③4．15 HU、④3．18 HU和⑤3．87
HU。其中①③⑤3只动物的CT图像肉眼可以分辨出
梗死灶。考虑可能由于本实验所选择测定CT值的范
围较大，所选范围内可能既包含梗死区域也包含非梗
死区域，从而导致了两侧大脑半球所测范围CT值的
差值偏小㈣。
梗死灶的大小、部位、缺血程度决定着梗死灶在
CT上的表现时间。肖恩华等同报告，250例脑梗死患者
中有8l例在6 h内CT出现阳性表现， 占32．4％ 。
Kueinski等[11】研究发现有84％的患者于起病后2h行
CT平扫可出现脑实质密度降低。这些结果间的差异，
主要与作者选择病例的标准不同有关。本实验是利用
线栓阻断大脑中动脉主干．血流完全阻断，不会发生
梗死局部漏血或血管再通现象；
梗死范围较大．同一
时间缺血范围基本一致：梗死过程迅速，于线栓插入
后立即发生。因此，本实验中大鼠脑梗死后CT征象出
现相对较早，易于观察。结果表明，缺血后3 h，5只动
物中有3只出现肉眼可分辨的梗死灶，占60％。其他
脑梗死模型的实验结果可能会存在一定程度的差异。
本实验结果说明在血管栓塞性脑梗死中．梗死后
3 h进行CT平扫，60％的动物出现肉眼可见的低密度
灶，可以为此类脑梗死的早期诊断提供实验依据和临
法律与医学杂志2005年第l2卷(第4期)
床参考。但由于外伤性脑梗死有多种致伤因素．不同
机理所引起的脑梗死出现CT征象的时间不尽相同．
要依据CT征象准确的判断梗死时间．尚需进行大量
的实验研究和进一步探讨。但本实验通过测定梗死
健、患侧CT值的差值并结合临床表现．可以作为推断
脑梗死发生时间的一种参考方法。
参考文献
[1】刘运生，欧阳姗．神经系统疾病诊断治疗学[M】．北京：人民军医出版
社，2003，382
[2】 肖芝豹，郭小蓝，赖文雄，等．大脑中动脉供血区早期脑梗塞CT诊断
[JJ．中国现代医学杂志，2003，13(14)：95~96
[3】 陈彦芳，吴恩惠，刘国栋，等．实验性急性脑梗塞早期CT表现与病理
基础研究[J】．中华放射学杂志，1994，28(12)：843~845
[4】徐茂竹．CT扫描在大面积脑梗死中的应用[JJ．临床荟萃，2001，16(17)：
803—803
[5】 Zea Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et a1．Reversible middle
cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke，1989，
20：84—91
[6】林顺发，彭仁罗，等．急性脑梗塞早期CT、MRI诊断研究进展[JJ．中国
医学影像技术，2000，16(10)：91 1—912
[7】 肖恩华，刘顾岗，杨树仁，等．24小时内缺血性脑梗塞的CT研究[JJ．放
射学实践，1999，14(2)：80 83
[8】 Kureiwa T， Seida M，Tomida S，et a1． Discrepancies among CT，
histological an d blood-brain barrier findings in early cerebral
ischemia[J]．J Neurosurg，1986，65：5 17~524
[9】陈芷若，臧暑雨．急性脑梗塞的早期CT和MRI改变[J]．临床神经病
学杂志，1999，12(3)：187~188
[10】Dzialowski I，Weber J，Doerfler A，et a1．Forsting M，Van Kummer
R． Brain tissue water uptake after middle cerebral artery occlusion
assessed with CT[J]．J Neuroimaging 2004，14(1)：42~48
[1 1】Kucinski T，Koch C，Gizyska U，et at．The predictive value of early
CT and angiography for fatal hemispheric swelling in acute stroke[J]．
AJNR，1998，19：839~846
(收稿：2005—05—24；
修回：2005—09—23)

相关热词搜索：