ST6-40转基因棉花株系的获得与耐盐性鉴定
朱永红,吴慎杰,李 静,张换样,焦改丽,竹梦婕,秦丽霞
(1.山西农业大学 棉花研究所,山西 运城 044000;
2.棉花生物学国家重点实验室,河南 安阳 455000)
棉花是世界上重要的经济作物之一,我国人口多耕地少,粮棉争地的矛盾一直比较突出。提高棉花品种的耐盐性,发展盐碱地植棉,拓宽植棉面积对于我国棉花生产以及粮食生产具有重要意义[1]。从“七五”开始,我国开始开展棉花耐盐碱育种工作,山东农业大学等单位已经育成了山农N0、2F502-2、商丘40一些耐盐性较好的品种[2]。然而,常规耐盐育种选育的棉花品种遗传基础狭窄,选育周期长,且常规品种耐盐能力很有限。而且传统的遗传育种方法并不能很有效地提高植株耐盐胁迫应答能力[3-4]。因此,利用基因工程技术培育棉花抗逆(高盐、干旱、低温等)新品种已经成为棉花育种领域的新趋势。
利用基因工程技术研发耐盐棉花品种,已经进行了大量的研究。例如,嗜盐孢子菌H+-PPase基因TsVP在高盐条件下可改善棉花根和茎的生长和光合活性。与野生型相比,转基因植物的膜离子泄漏和丙二醛水平降低,转基因植物有助于Na+和Cl−在液泡的隔离。TsVP的表达也提高了棉花的发芽率和存活率,在高盐环境下改善纤维质量。另一项研究表明,拟南芥液泡焦磷酸酶编码AVP1的表达改善了转基因棉花在盐胁迫下的生长和纤维产量[5]。ST6-40基因是采用功能基因挖掘的方法分离得到的。在盐胁迫下,基于小盐芥cDNA文库的表达,构建源种质cDNA表达文库,利用农杆菌介导法转化拟南芥,建立了超过125 000个独立株系组成的转基因种子文库,通过高通量遗传筛选法筛选耐盐株系,分离出多种耐盐株系,通过PCR扩增和测序鉴定小盐芥CDNA,分离得到了ST6-40基因。这种功能基因挖掘方法强调了表达基因的功能,因此克隆的基因与耐盐功能直接相关。在拟南芥过量表达ST6-40基因,植物根系长度、叶片及株高都有显著提高[6-7],但有关其耐盐机理目前尚不清楚。
本研究拟将ST6-40基因转入棉花品种R15中,通过对获得的转基因株系进行多代的PCR鉴定和耐盐鉴定,以获得ST6-40基因能稳定遗传且耐盐性强的转基因棉花品系,旨在为培育抗逆性棉花新种质提供科学参考。
1.1 试验材料
R15,为山西农业大学棉花研究所利用陆地棉品种晋棉7号经过多代再生选育出的胚胎发生纯合系;
陆地棉耐盐对照品种中99807,由中国农业科学院棉花研究所提供;
pCB2004-ST6-40重组载体(图1),由中国科技大学生命科学学院实验室构建并提供;
利用农杆菌介导法转化R15受体,并通过PCR检测[8]获得ST6-40转基因阳性棉花株系ST6-40-1~ST6-40-65。
图1 重组载体pCB2004-ST6-40示意Fig.1 Schematic representation of the recombinant vector pCB2004-ST6-40
1.2 试验方法
1.2.1 目的基因ST6-40的核苷酸序列和蛋白序列分析利用生物信息学对目的基因ST6-40(NCBI序列号:ACF23021.1)的核苷酸序列和蛋白序列进行分析。
1.2.2 农杆菌介导的棉花遗传转化法以R15为受体,以下胚轴为外植体,参考陈志贤等[9]的方法构建转基因棉花。T0按单株种植,并进行PCR检测[8],检测结 果为阳性 的单株,后 代经T1、T2、T3连续3代按株行种植,先后进行叶片喷草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因PCR检测,检测结果全为阳性的植株确定为ST6-40转基因棉花纯合株系。
1.2.3 转基因棉花的PCR鉴定及纯合系筛选在超净台上取再生小植株2~3片嫩叶,CTAB法提取R15材料和转基因棉花的基因组DNA,并稀释至100 ng/μL。通过PCR和产物测序鉴定其纯合性,反应体系为25μL,包 括2.5µL 1×PCR buffer,1.5μL 1.5 mmol/L MgCl2,2.0μL 0.2 mmol/L dNTPs,0.5μL P1(0.2μmol/L)引物(表1),0.5μL P2引物(0.2μmol/L),2.0μL Template DNA,0.5μLTaqDNA聚合酶,15.5μL ddH2O。PCR反应程序为:95℃预变性3 min;
循环扩增阶段:95℃40 s→58℃30 s→72℃60 s,循环35次;
最后72℃延伸保温7 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.4ST6-40转基因棉花RNA水平上的鉴定取0.05~0.10 g的幼嫩叶片,分别按照RNA抽提试剂盒(TransZol Plant ET121,Trans)和cDNA一链合成试剂盒(Cat#PR037A,TaKaRa)说 明 提 取RNA并反转录为cDNA。采用SYBR Green Su‐permix(大连宝生物公司)进行定量PCR反应。反应体系为10µL:包括1.0µL 1×PCR buffer,1.0μL 1.5 mmol/L MgCl2,1.0μL 0.2 mmol/L dNTPs,0.2μL P1(0.2μmol/L)引物(表1),0.2μL P2引物(0.2μmol/L),1.0μL Template DNA,0.2μLTaqDNA聚合酶,5.4μL ddH2O。反应程序:95 °C 20 s;
94 °C 3 s,60 °C 30 s,扩增40个循环。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequence
1.2.5 转基因棉花耐盐性鉴定T1、T2转基因阳性植株采用盆栽种植,在花铃期用300 mmol/L NaCl浇灌胁迫7 d后采用酸性茚三酮法[10]测定叶片游离脯氨酸含量,以判断棉花耐盐性差异,游离脯氨酸含量高的品系判定为耐盐性较好。
1.2.6 T3转基因棉花耐盐性鉴定将T3阳性纯合株系转基因棉花及受体对照种子播种于育苗盘中,每个待测材料进行3次重复,每个重复种50株,试验管理按照转基因生物安全要求进行。80%苗长至2叶时,将育苗盘放入底部隔水的盐池,在盐池底部浇入1.5%的盐水,盐水以刚没过育苗盘为准。施盐后7 d调查棉苗受害情况,每个待测材料调查3个重复,每个重复随机调查20株。根据棉花盐害分级方法和盐害指数计算方法,计算待测棉花材料的盐害指数。利用SPSS 22.0统计分析软件对试验结果进行方差分析。盐害分级症状描述如下:0级,棉苗无黄叶;
1级,有1片子叶发黄;
2级,2片子叶均发黄;
3级,有1片子叶受害脱落;
4级,有2片子叶受害脱落。
2.1 目的基因ST6-40生物信息学相关分析
目的基因ST6-40((NCBI序列号:ACF23021.1)cDNA全长为510 bp,编 码169个 氨 基 酸,分 子 质量为18 124.08 u,理论等电点为8.66,分子式为C813H1325N209O244S6。对转基因阳性植株进行测序,结果显示,其序列与NCBI数据一致,没有基因突变。
2.2 T0的ST6-40转基因棉花PCR鉴定
对200棵T0转基因植株进行PCR鉴定,共获得65个阳性株系,转化率为19%。如图2所示,10个T0转基因再生苗中,L1和L35为阴性转基因棉花,其余为阳性转基因棉花。进一步将获得的T0阳性棉花再生苗嫁接到温室内,其中有60株收获到种子。
图2 T0转基因棉花PCR检测Fig.2 PCR detection of T0 generation of transgenic cotton
2.3 稳定遗传的后代转基因棉花鉴定
2.3.1 T1、T2转基因棉花鉴定对60个T1转基因株系进行PCR鉴定(图3),共得到48个T1的ST6-40转基因棉花阳性株系,其中,34个T1转基因阳性株系的脯氨酸含量高于对照,且L2、L5、L14、L18、L22、L26、L29、L47共8个株系的脯氨酸含量显著或极显著高于对照(P<0.05或P<0.01)(表2)。
对34个T2转基因株系进行PCR鉴定,结果均为阳性转基因棉花(图3),其中31个的游离脯氨酸含量高于对照R15,且L2、L5、L14、L18、L22、L29、L55、L56共8个株系的脯氨酸含量显著或极显著高于对照(P<0.05或P<0.01)(表2)。
图3 T1~T3转基因棉花在分子水平的鉴定Fig.3 Molecular identification of T1-T3 transgenic cotton lines PCR detection and qRT-PCR detection
表2 转基因棉花的游离脯氨酸含量及苗期盐胁迫下的盐害指数Tab.2 Free proline content of transgenic cotton and salt damage index in seedling stage under salt stress
2.3.2 T3转基因棉花鉴定T1、T2连续2代游离脯氨酸含量显著高于受体对照R15的7个株系,继续种植收获T3种子,经过对叶片喷草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因进行PCR检测,将植株叶片均抗草铵膦、且PCR检测均为阳性的株系确定为转基因阳性纯合株系,共筛选出6个转基因纯合系(图3)。
T3耐盐鉴定共鉴定6个转基因纯合株系、1个常规耐盐品系(中99807)及1个受体品系(R15),结果如表2所示,转基因株系及中99807盐害指数均低于受体对照R15,其中转基因株系L2、L5、L22、L29的盐害指数显著低于转基因受体对照R15,表明转ST6-40基因棉花株系的耐盐性比受体对照显著提高。与常规耐盐品系中99807相比,有4个转基因品系的盐害指数较低,其中转基因株系ST6-40-L2的盐害指数显著低于中99807。表明转入ST6-40基因能有效提高棉花品种耐盐性。
此外,对盐胁迫下的植株生长情况进行观察,可以看出,在苗期和花铃期转基因棉花植株的生长势、萎蔫程度等方面均优于受体对照品种(图4)。
图4 转基因棉花苗期、花铃期耐盐鉴定Fig.4 Identification of salt tolerance during seedling and bell period of transgenic cotton
近10余年来,我国转基因抗逆棉花品种选育取得了重要进展,挖掘了EDT1等一批能明显提高棉花品种抗旱、耐盐性的基因[10-11]。选育了一批转基因抗旱耐盐棉花新品种,为我国棉花抗逆育种提供了丰富的种质资源。在棉花转基因耐盐育种研究方面,发掘了一批耐盐基因,获得了一些转基因耐盐棉花新材料,主要包括TsVP基因棉花、HcVP基因棉花、TaNHX2基因棉花等,以及拟南芥AtNHX1基因、大豆GmNHX1基因和百脉根LcVP1基因等。应用较多的是与代谢相关的植物转录调控基因,主要包括甜菜碱CMO基因、大肠杆菌的beTA基因和小盐芥ST6-40基因等[12-15]。研究发现,在拟南芥过量表达ST6-40基因,植物根系长度、叶片及株高都有显著提高[16-17]。本研究利用ST6-40基因构建了重组载体pCB2004-ST6-40,采用农杆菌介导法将其转入棉花品种R15,共进行了350个转化事件,转化率为19%,获得65个阳性T0株系,其中再生植株中90%为阳性苗。转化效率及阳性率高于其他转基因棉花,表明我们建立的遗传转化体系高效稳定,经过对叶片喷施草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因进行PCR检测双重筛选阳性植株的方法,确保筛选鉴定出转基因阳性纯合株系。
耐盐鉴定基本采用测定游离脯氨酸、丙二醛等生理指标来鉴定[18-20],本研究为获得稳定的耐盐转基因棉花,对T1所获得的48个阳性转基因棉花进行游离氨基酸测定,发现34个的含量高于对照,进一步对其T2鉴定,31个的含量高于对照,其中连续2代的游离脯氨酸含量均显著高于对照的是L2、L5、L14、L18、L22、L29共6个株系。此外,利用盐胁迫下棉花植株叶片受损程度来计算盐害指数,该方法能够较客观地反映盐胁迫下棉花植株的生长状况,筛选的的棉花材料在生产上适应性更强[21-22]。本研究对前述6个株系的T3鉴定发现,均为阳性转基因;
且盐害指数结果表明,L2、L22、L5、L29均优于中99807,其中L2显著优于中99807,表明转ST6-40基因棉花品系耐盐性较强。因此,鉴定筛选的转基因耐盐品系生产适应性更强[23]。
转基因耐盐育种作为一种高效的棉花耐盐育种手段,本研究通过构建pCB2004-ST6-40重组载体,利用农杆菌介导法将ST6-40基因转入棉花基因组,经耐盐性鉴定,获得耐盐性显著增强的转基因棉花株系,为棉花耐盐育种创制了新的种质材料,加快棉花耐盐育种进程。此外,基于该研究已经申报并获批了ST6-40-2等4个耐盐性表现突出的ST6-40转基因棉花株系的转基因生物安全中间试验,下一步将利用杂交、回交等常规育种技术,进一步改良这些材料的农艺性状和产量性状,为棉花耐盐育种提供优异种质来源。
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中国共产党第三代中央领导集体的卓越贡献
中国共产党第三代中央领导集体的卓越贡献 --------------继往开来铸就辉煌 【摘要】改
【成语大全】 日期:2020-03-20
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信息技术2.0能力点 [全国中小学教师信息技术应用能力提升工程试题题库及参考答案「精编」]
全国中小学教师信息技术应用能力提升工程试题题库及答案(复习资料)一、判断题题库(A为正确,B为错误)
【格言】 日期:2020-11-17
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党建工作运行机制内容有哪些_构建基层党建工作运行机制探讨
党的基层组织是党在社会基层组织中的战斗堡垒,是党的全部工作和战斗力的基础。加强和改进县级以下各类党的
【经典阅读】 日期:2020-01-22
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集合推理_七,推理与集合
七推理与集合1 期中考试数学成绩出来了,三个好朋友分别考了88分,92分,95分。他们分别考了多少分
【名人名言】 日期:2020-12-18
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电大现代教育原理_最新国家开放大学电大《现代教育原理》形考任务2试题及答案
最新国家开放大学电大《现代教育原理》形考任务2试题及答案形考任务二一、多项选择题(共17道试题,共3
【成语大全】 日期:2020-07-20
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2023年和儿媳妇在一起幸福的句子3篇
和儿媳妇在一起幸福的句子1、假如人生不曾相遇,我还是那个我,偶尔做做梦,然后,开始日复一日的奔波,淹没在这喧嚣的城市里。我不会了解,这个世界还有这样的一个你
【格言】 日期:2023-11-10
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最满意的三项工作200字【最新党办公务员副主任提拔考察个人三年思想工作总结报告】
党办公务员个人三年工作总结近三年来,本人在组织、领导的关心指导和同事们的团结协作下,尽快完成主角的转
【格言】 日期:2021-02-26
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关于三农工作重要论述心得体会3篇
关于三农工作重要论述心得体会3篇关于三农工作重要论述心得体会篇1习近平总书记指出:“建设现代化国家离不开农业农村现代化,要继续巩固脱贫攻坚成果,扎实推进乡村
【学习心得体会】 日期:2022-10-29
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【福生庄隧道坍塌处理方案】 福生庄隧道在哪里
(呼和浩特铁路局大包电气化改造工程指挥部,内蒙古呼和浩特010050)摘要:文章介绍了福生庄隧道
【学习心得体会】 日期:2020-03-05
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五个一百工程阅读心得体会13篇
五个一百工程阅读心得体会13篇五个一百工程阅读心得体会篇1凡益之道,与时偕行。在全国网络安全和信
【学习心得体会】 日期:2022-12-07
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城管系统警示教育心得体会9篇城管系统警示教育心得体会篇1各党支部要召开多种形式的庆七一座谈会,组织广大党员进行座谈,回顾党的光辉历程,畅谈党的丰功伟绩,
【学习心得体会】 日期:2022-10-09
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发展对象培训主要内容10篇发展对象培训主要内容篇1怀着无比激动的心情,我有幸参加了__新区区委党校20__年第四期(区级机关)党员发展对象培训班。这次的学习
【培训心得体会】 日期:2022-09-24
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扶眉战役纪念馆心得体会11篇扶眉战役纪念馆心得体会篇1有那么一段历史,低诉着血和泪的故事,慢慢地,随岁月老去;有那么一群人,放弃了闲逸的人生,辗转奔波中
【学习心得体会】 日期:2022-08-03
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2022年全国检察长会议心得7篇2022年全国检察长会议心得篇1眼睛是心灵上的窗户,我们通过眼睛才能看到世间万物,才能看到眼前这美好的一切。拥有一双明亮的眼
【学习心得体会】 日期:2022-10-31
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全面从严治党的心得体会800字7篇全面从严治党的心得体会800字篇1中国特色社会主义是我们党领导
【学习心得体会】 日期:2022-12-14
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矫正心得体会6篇矫正心得体会篇1今天,是自己出监后第一次参加阳光中途之家组织的社区矫正方面的教育
【学习心得体会】 日期:2022-12-24
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2月教师党员个人思想汇报5篇
2月教师党员个人思想汇报敬爱的党组织:最近这一个月的时间对于我来说是极不平凡的,在这段时间里我认真学习了文化部网上党校的相关内容,经过长达40小时的
【教师心得体会】 日期:2023-10-15
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2024年主题教育民主生活会批评与自我批评意见(38条)(范文推荐)
2023年主题教育民主生活会六个方面个人检视、相互批评意见:1 理论学习系统性不强。学习习近平新时代中国特色社会主义思想不深不透,泛泛而学的时候多,深学细照的时候少,特...
【邓小平理论】 日期:2024-03-19
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2024年交流发言:强化思想理论武装,增强奋进力量(完整)
习近平总书记指出:“一个民族要走在时代前列,就一刻不能没有理论思维,一刻不能没有思想指引。”党的十八大以来,伴随着新时代中国特色社会主义思想在实践中形成发展的历程...
【三个代表】 日期:2024-03-19
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2024年度镇年度县乡人大代表述职评议活动总结
xx镇20xx年县乡人大代表述职评议活动总结为响应县级人大常委会关于开展县乡两级人大代表述职评议活动,进一步激发代表履职活力,加强代表与人民群众的联系,提高依法履职水平...
【马克思主义】 日期:2024-03-19
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“千万工程”经验学习体会(研讨材料)
“千万工程”是总书记在浙江工作时亲自谋划、亲自部署、亲自推动的一项重大决策,也是习近平新时代中国特色社会主义思想在之江大地的生动实践。20年来,“千万工程”先后经历...
【三个代表】 日期:2024-03-19
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2024年在市政协机关工作总结会议上讲话
同志们:刚才,XX同志对市政协机关20XX年工作进行了很好的总结,很精炼,很到位,可以感受到去年机关工作确实可圈可点。XX同志宣读了表彰决定,机关优秀人员代表、先进集体代...
【邓小平理论】 日期:2024-03-18
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在全区防汛防涝动员暨河长制工作推进会上讲话提纲【完整版】
区长,各位领导,同志们:汛期已经来临,我区城区防涝工作面临强大考验,形势不容乐观。年初,区城区防涝排渍指挥部已经召开专题调度会,修订完善应急预案,建立网格化管理机...
【马克思主义】 日期:2024-03-18
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2024年镇作风整治工作实施方案(完整文档)
XX镇作风整治工作实施方案为深入贯彻落实党的二十大精神及省市区委深化作风建设的最新要求,突出重点推进干部效能提升,坚持不懈推动作风整治工作纵深发展,根据《关于印发《2...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
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2024市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案【优秀范文】
xx市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案为持续优化法治化营商环境,激发市场主体活力和社会创造力,规范行政执法行为,创新行政执法方式,提升行政执法质效,着力解...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
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2024年度关于开展新一轮思想状况摸底排查工作通知(完整)
关于开展新一轮思想状况摸底排查工作的通知为深入贯彻落实关于各地开展干部职工思想状况大摸底大排查情况上的批示要求和改革教育第二次调度会议精神,有针对性做好队伍教育管...
【三个代表】 日期:2024-03-18
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2024年公路养护中心主任典型事迹材料(完整文档)
“中心的工作就是心中的事业”——公路养护中心主任典型事迹材料**,男,1976年6月出生,1993年参加工作,2000年4月调入**区交通运输局工作,大学本科学历,中共党员,现任**...
【马克思主义】 日期:2024-03-17