等位基因分型标准物的法医应用及制备研究:ao分型
【摘要】短串联重复序3~J(short tandem repeats,简称STR)由于其本身的优点和检测技术的不断完善,在今后相当长的时间内仍将是法医应用的重要遗传标记。等位基因分型标准物是STR检测试剂盒的组成部分,能够保证各等位基因分型的准确性。本文对
等位基因分型标准物的出现、在法庭科学上的应用以及目前制备方法进行了综述,并对各种制备方法进行比较,以期对各实验室按
照实际需要自行制备相关STR的等位基因分型标准物在方法选择上有所帮助,从而更好地进行法医物证鉴定。
【关键词】短串联重复序列;
等位基因分型标准物;
法医学应用
【中图分类号】Q78
【文献标识码】A
【文章编号】1007—9297(2005 J03—0231—04
Study on the forensic applications and the construction of alleHc ladder.YUAN li,LU di.(Beijing institute ofForensic Medicine and
Science,Beijing]OOO4O,China)
【Abstact】 Shoa tandem repeats (STRs)ale important genetic markers and widely used in Forensic community because of theirs
characteristics and advanced examine techniques. Allelic ladder is importan t part of STR kit and ensure the precise genotype of allelic.
This article states the appearance an d forensic application of allelic ladder, and also study on the methods of construction of allelic ladder
currently、Through the comparisons of those construction methods,this issue to be solved the laboratory to select which method to construc—
tion allelic ladder according its needs and condition and to make the most of the forensic judge.
【Keywords l Short tandem repeats;
Allelic ladder;
Forensic application
一
、等位基因分型标准物的出现
PCR—STR分型技术具有高效、快速、灵敏等优点,
在个人识别、亲子鉴定、基因绘图上发挥了重要作
用.【l】已经成为法医物证鉴定的主流技术。虽然单核苷
酸多态性(single nucleotide polymorphism,即SNP)
被广泛称为第三代DNA遗传标记,但由于其成本高,
实际操作困难等.推广使用还需要很长一段时间。目
前和今后相当长的时期内STR仍是主要使用的遗传
标记。
当使用以PCR为基础的STR多态性的分析技术
时。为了各基因座的等位基因命名,需要一个能比对
的标准物。早先测试STR的等位基因命名曾采用片断
长度bp值方法,是与已知分子量标准物同步电泳并
进行比较。这种分子量标准物虽然在本质上也是
DNA 但经多次实验发现这种方法存在较严重的缺
陷:相同分子量的DNA片段和分子量标准在同一介
质电泳时会出截然不同迁移率的条带。【31 DNA在介质
中的电泳迁移率在其他条件相同的情况下不仅与其
分子量有关,还受DNA 自身的序列结构影响。序列不
同的DNA片断在电泳动力学上存在差异,即使片断
长度相同.它们的电泳迁移率却不一致。这样就不能
准确进行STR分型。
最早记载有等位基因分型标准物的是Budowle
等[41建立的。他们从100名无关个体中找出D1S80的
16个等位基因.经测序命名后把它们混合作为“lad.
der”.检测未知样品时.只需与该基因座的“ladder”比
较即可得出这个基因座的基因型.当时用的是聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离和银染显色。这种检测方法与在此
之前的斑点杂交和SoutheYn印迹技术来检测限制性
片段长度多态性方法相比有很多优点。在节约时间和
降低错误率上尤为明显。Margaret C等在1996年通过
不同分型标准物的比较.进一步证明使用等位基因分
型标准物(allelie ladders)才能对等位基因进行正确分
型,其数据才可以在实验室之间进行交换。圈
二、等位基因分型标准物的概念及法医学
应用
等位基因分型标准物(allelie ladder)是人群中常
见的等位基因混合物,用来与未知样品比对确定基因
【作者简介】袁丽(1971一),女,硕士研究生,江西九江人,主要从事法医DNA检验工作。Tel:+86—10-68621174;
E—mail:yuanliw—
cy@yahoo.com.cn
· 232·
型。同一检材用不同的引物序列进行扩增(不同作者
设计的引物、退火位置不同,可能会出现同一靶座位
上相同等位基因长度不同)或者用不同的探测平台来
分析,那么出现的结果可能不一致。这时我们可以将
该结果与对应的allelic ladder相比较,等位基因峰值
就可以准确地转换成基因分型。而后者是最广泛地进
行STR图谱比较的表达方式,基因分型结果可在实验
室内部及实验室之间进行比较。
为了保证实验室之间的数据重复性和可比性.国
际法医血液遗传学会(International Society of Forensic
Haemogenetics,ISFH )在1994年【6】和1997年 对等
位基因提出了命名原则.一般是根据它的重复单位的
重复次数来命名的。[81 1997年会议针对等位基因分型
标准物的应用提出具体要求:等位基因分型标准物中
的所有等位基因应按规则进行测序和命名;
无论是购
买商业化试剂盒还是实验室自己制备,等位基因分型
标准物应涵盖所有常见的等位基因,并尽可能拥有罕
见的等位基因,以便可以得到未知样品准确的基因分
型。
STR遗传标记的地位决定了allelic ladder在法庭
科学中的重要作用。allelic ladder保证了对应STR基
因座的等位基因正确命名。由于STR位点的某一等位
基因在片段大小及序列上是惟一的,其在同等条件下
电泳的迁移率也是一致的。对未知样本进行基因分型
有人工和自动化方式两种:用银染显色方法检测未知
样品的DNA时,与其旁边泳道的allelic ladder比对即
可进行基因分型;
如用毛细管电泳(Capillary Elec—
trophoresis,简称CE)检测,将结果与该特异基因座的
等位基因分型标准物相比较,等位基因峰值就可以自
动准确地转换成基因分型。
三、等位基因分型标准物的制备
虽然市场上有商品化的STR试剂及其对应的al—
lelic ladder可供选择,但很多情况下实验室需要自己
制备。目前分型标准物主要依靠外国几家大公司进
口,其制备技术保密,价格昂贵,并且提供的STR基因
座有限,有些在中国群体中识别率和非父排除率高的
STR基因座没有纳入商品化试剂盒。
筛选等位基因是制备ladder的首要步骤.通过群
体调查,筛选、分离出所有目的STR基因座的等位基
因DNA。然后对靶座位等位基因片段进行测序,根据
STR等位基因命名原则,确定每个样品基因型后.选
取纯合子;
在有相应基因座的商品化的Ladder或标准
片段长度后,则用标准物从人群中筛选相应的等位基
因。如果遇见罕见基因只有杂合子时.可用分辨率高
法律与医学杂志2005年第l2卷(第3期)
的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,【91选取含有目的基因的
凝胶进行胶回收以获得单个的罕见等位基因。制备
allelic ladder方法如下
(一)混合各DNA,PCR 扩增,产物为allelic lad—
der
筛选出所有等位基因片段的DNA,调整各DNA
终浓度达到一致,取等体积混合,扩增混合物,其产物
作为allelic ladder。
这种方法优点是作为模板的
DNA混合物易保存,缺点是不适合于大量生产,一旦
模板DNA用完,需再次调配混合DNA。
(二)单个扩增DNA.混合PCR 扩增产物作为
allelic ladder
单个扩增各等位基因DNA,PCR扩增,产物混合
浓度调平衡后直接作为allelic ladder。该方法特点是
可通过单个的扩增,增强信号强度、扩大体积,将所有
等位基因混合基因座ladder时.如同调制“鸡尾酒”一
样来达到各成分之间的平衡。该方法与上述方法有同
样的缺点
(三)以混合好的等位基因扩增产物为模板.再扩
增制备allelic ladder
将含有sTR基因座上的各个等位基因的样品单
个进行扩增,扩增产物按比例混合,当达到各等位基
因之间平衡后利用混合物作为模板,稀释1/1000—1/
1000 000倍后再次扩增。将再次扩增的产物作为等位
基因分型标准物。⋯l该方法操作简便,只需一次性调
平衡,是一种常用的制备方法,但也有诸多缺点:作为
模板的扩增产物容易降解,不如以DNA为模板能长
期保存稳定;
其次,再次扩增产物中非特异带增多,影
响Ladder的判读;
再者,当稀释倍数不够高时,可能会
出现优先扩增现象,等位基因峰值呈现梯度下降趋
势,这样就难以达到等位基因之间的最终平衡。
(四)采用克隆技术大量制备STR 基因座的allehc
ladder
中国学者张林等率先在国内外报道采用分子克
隆技术制备STR基因座的allelic ladder.㈣目前,在国
内有几家实验室开展了这项工作,均采用T—A连接、
蓝白斑挑选方法。[13.14]首先对筛选出的纯合子进行
PCR扩增,扩增产物进行聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,
银染或EB显色,回收胶DNA,稀释后再次PCR扩增,
产物纯化后将其插入质粒载体中。将重组质粒导人大
肠杆菌,培养大肠杆菌,从而获得单一DNA分子的大
量拷贝。筛选正确的阳性克隆并用质粒通用引物对重
组质粒进行DNA测序分析证实插入片段的结构大
小,按重复单位的重复次数对插入的等位基因片段进
法律与医学杂志2005年第l2卷(第3期)
行命名。需要制备等位基因分型标准物时,提取质粒,
进行PCR扩增。混合并调平衡所有的等位基因即可。
挑选正确克隆的大肠杆菌。其培养液与甘油混合后一
70℃保存。
allelic ladder的制备是试剂制备工作的难点,综
观上述方法,各有优缺点。前3种方法操作相对简便,
对实验室要求不高,制备量一般能满足实验室内部需
求。适合于普通实验室的制备。在保质、保量、长期供
应方面,显然前3种方法有缺陷。长期保存PCR产物
容易降解,稳定性差;
需要大量制备时,如果用于制备
等位基因分型标准物的模板用完.由于每个样品DNA
的浓度和含量不同,那就必须从头开始寻找模板。再
次优化反应条件,这样既费时又增加了工作量。而克
隆方法在克隆成功后。可以通过培养细菌来大量制备
等位基因,对保留罕见等位基因尤为方便。而且,可以
长期冷冻保存细菌,随时制备等位基因分型标准物。
但困扰大家的是该方法对实验室装备要求高。前期实
验费用大,对实验过程操作和防污染更加严格。
无论哪种方法制备。等位基因分型标准物中的等
位基因一般要经DNA测序确定这些等位基因的片段
长度与序列(重复序列重复次数),明确等位基因分
型。在这点上,克隆方法有优势。利用克隆的方法制备
allelic ladder.对重组质粒进行测序,用的是质粒通用
引物,测序的片段延长,按国际命名原则进行命名,有
效解决了统一命名的问题。而前3种制备方法,各实
验室对同一个基因座进行测序的引物可能不同.再者
目前对小片段的等位基因进行测序比较困难。这就有
可能导致命名混乱的问题。
目前制备好的allelic ladder的保存是个难点。等
位基因分型标准物作为DNA的扩增产物,其本身不
易于长期保存,而且标记的荧光染料基团随时间的推
移与DNA片段结合力下降, 以致荧光检测信号降低
而影响基因分型,而成熟的试剂公司技术保密,目前
尚未见到有良好的方法来稳定ladder。
四、制备等位基因分型标准物的质控
试剂的质量控制是基因正确分型的关键。等位基
因分型标准物的质控占有举足轻重的地位。首先在标
准对照体系的构建上,应当包含该基因座所有常见等
位基因,并且每一等位基因均经序列测定准确无误。
对该标准对照的电泳迁移率应作充分的研究.最终确
定其自动分析所需数据。其次,在如何控制质量方面。
应当贯彻分批生产、分批控制、抽样检测的原则。由于
荧光标记STR复合扩增检验试剂有一定的有效期.现
实可行的是分批生产,同时分批控制其质量.并且进
· 233·
行抽样检测和出厂前检测。每批试剂的质量必须均
一
,并且留样可查。对于整个试剂制备流程来说,分步
骤、分组地细化进行质量控制是有效的方法。并对整
个制备的流程进行了功能分区。再者,要建立严格的
质量责任制度。从程序和制度上来保证荧光标记STR
复合扩增检验系统的质量。对质控检测全过程具有完
整的实验记录。
等位基因分型标准物是STR试剂盒中的重要成
分,其大规模制备是实现STR试剂国产化的前提和条
件,对打破进口试剂的垄断、制备适合中国人群的
STR试剂、降低办案科研以及建立DNA数据库经费
大有意义。
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(收稿:2005-04—07,修回:2005-07—2O)
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