生物分子学,第8章,杂交与芯片技术

第八章 杂交与芯片技术 学习目标 掌握：1．核酸分子杂交的基本概念。

2．探针的种类与标记方法。

3．常见核酸分子杂交技术的原理。

4．DNA芯片的设计与制备。

熟悉：1．核酸分子杂交信号的检测方法。

了解：1．核酸杂交与DNA芯片技术的应用。

第一节 杂交的基本概念 杂交（hybridization）是指不同来源的单链核酸根据碱基互补配对原则，在适当的条件下形成杂化双链的过程。利用核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂交技术，该技术是定性或定量检测靶DNA或靶RNA的有力工具。为区分杂交体和单链核酸分子，通常需要对参与杂交反应的寡核苷酸分子进行标记，这段被标记的寡核苷酸称为探针。探针能与靶核酸序列互补，可在适当条件下，通过碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交，反应结束后可根据标记信号判断靶核酸序列的位置和含量。

一、核酸分子杂交 核酸杂交是基于核酸变性和复性的特性建立的。我们知道，变性DNA的两条互补链在适当条件下可恢复天然的双螺旋构象，是因为两条链之间存在碱基配对关系。因此，如果将不同种类的单链DNA分子或RNA分子放在一定条件下的同一溶液中，只要两条单链核酸分子之间存在一定程度的碱基互补配对，就有可能形成杂化双链（heteroduplex）。我们把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为核酸分子杂交。这种杂化双链可以是不同的DNA和DNA单链之间形成，也可以是RNA和RNA单链分子间形成，甚至是DNA单链分子和RNA单链分子之间形成，见图8-1。

图8-1核酸杂交原理示意图 核酸杂交的分类主要有以下划分方式，根据杂交核酸分子的种类分为DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA。根据杂交探针的不同分为放射性核素杂交和非放射性核素杂交。根据杂交介质不同分为液相杂交、固相杂交和原位杂交。

核酸分子杂交技术是将来源不同的核酸片段，按照碱基互补配对规律形成异源双链，对DNA或RNA进行定性或定量分析的一项技术。利用核酸杂交技术，可以研究不同物种或个体DNA之间的亲缘关系，发现靶基因的缺失或突变，通过标记信号的强度测定某种遗传信息量的多少，证明某种疾病(如肿瘤)是否与某种基因(如病毒基因)有关等。核酸分子杂交技术基本过程主要包括核酸分子探针的选择、探针的制备与标记、核酸分子杂交、杂交结果分析四个过程。制备标记合适的探针是核酸分子杂交技术成功的关键。

二、探针的类型 探针指的是一段带有检测标记的与目的DNA或目的RNA特异互补的已知核苷酸序列。根据探针的制备方法及核酸性质的不同，探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针四大类。

1．寡核苷酸探针　由公司设计合成，长度一般为18～30bp。

优点是：①制备方便，可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列；
②由于大多数寡核苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变杂交分析；
③比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。缺点是探针短，探针特异性差，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大，背景噪音也大。

2．基因组DNA探针　利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因组DNA探针。选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列的存在引起非特异性杂交而出现假阳性。优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。

3．cDNA探针　由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可，见图8-2所示。也可采用PCR方法扩增。该方法的优点是双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。

图8-2 cDNA探针的制备 4．RNA探针　分离的RNA或者利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以双链DNA为模板在体外转录而成。优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。②单链，不存在变性和自我复性。③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。缺点：RNA容易降解，标记方法也相对复杂。

三、探针的标记 为确定探针是否与相应核酸分子杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。理想的探针标记物应具备以下特性：①高度的灵敏性；
②不影响碱基配对的特异性；
③不影响探针分子的主要理化性质；
④对酶促反应活性无影响；
⑤检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。

核酸探针常用的标记物主要有两大类。一类是放射性标记物，如放射性同位素3H、32P、35S、125I等。以32P应用最普遍。

优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；
有很高的特异性，假阳性结果较少。缺点：易造成放射性污染；
存在同位素的半衰期限制。第二类是非放射性同位素标记物，如地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。优点是无环境污染、可较长时间贮存，缺点是灵敏度不高。

探针标记可以全程标记，亦可对探针的3′端或5′端进行标记。探针的体外标记法分为化学法和酶法：①化学法是利用标记物分子上的活性基因与探针分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。不同标记物有各自不同的标记方法，最常用的是125I标记和光敏生物素（photobiotin）标记。②酶法也叫酶促标记法，预先将放射性同位素或非放射性标记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。不同标记物有各自不同的标记方法，最常用的是125I标记和光敏生物素（photobiotin）标记。下面介绍几种常用的探针标记方法。

1．缺口平移法 缺口平移法（nick translation，NT）是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的多种酶促活性将标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。首先利用DNase I在DNA双链上造成单链切口；
然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5¢®3¢核酸外切酶活性在切口处将旧链从5¢末端逐步切除，最后在DNA聚合酶I的5¢®3¢聚合酶催化下，以dNTP为底物，按照碱基互补的原则，在切口的3¢末端-OH上合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中，见图8-3。该方法的优点是能够较好的控制探针的长度，且探针放射活性强。

图8-3 缺口平移法示意图 2．随机引物标记法 随机引物标记法（random priming，RP）的原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5¢®3¢方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，见图8-4。随机引物法所具有的优点有：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记；
操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题；
标记活性高；
可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。缺点是探针产量比缺口平移法低。

图8-4 随机引物标记法示意图 3．末端标记法 末端标记法是将核酸片段的5¢末端和3¢末端进行部分标记，故分为3¢末端标记和5¢末端标记。① 3′末端标记：在探针3′-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α-32P]dNTP。

3′末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3′标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段末端标记法和T4 DNA聚合酶标记法，见图8-5。② 5′末端标记 ：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5′-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使 ATP分子上的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5′－OH基团上。因此采用γ-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5′端标记。但核酸样品5′端必需是去磷酸的，见图8-6。

图8-5 3′末端标记法 图8-6 5′末端标记法 4．PCR标记法 在PCR反应体系中利用标记的核苷酸作为反应底物，以待标记的DNA片段为模板，PCR扩增结束后标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，制备成特异的探针分子，使用前必须进行探针变性处理。该方法获得的探针分子产量高。

四、杂交信号的检测 杂交后信号的检测方法选择取决于探针标记物的性质。常用核酸探针标记物和检测方法见表8-1。

表8-1常用核酸探针的标记和检测 标记物性质 标记分子 标记方法 检测方法 放射性物质标记 [α32P ]dNTP NT、PCR、RP 放射自显影 [γ32P ]dNTP 末端标记法 放射自显影 35S NT 放射自显影 非放射性物质标记 生物素 Bio-11-dUTP NT、PCR、RP 酶标亲和素或酶标 光敏生物素 600W可见光照 抗生物素抗体显色 生物素化补骨脂素 365紫外线照 抗生物素抗体显色 酶 过氧化物酶 化学合成法或直接法 直接底物显色或用酶 碱性磷酸酶 化学合成法或直接法 直接底物显色或用酶 荧光素 罗丹明和FITC 合成法 荧光显微镜观察或酶 半抗原 地高辛 RP、NT 酶标抗体+底物显色 1．放射性核素标记探针检测 放射性核素标记的探针杂交后常用放射自显影进行检测，该方法基于放射性核素释放的能量将照片纸感化的原理。32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。该方法的基本原理是同位素在不断衰变过程中释放出β-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影像，经过显影即可成像。

2．非放射性核素标记探针检测 非放射性核素标记的探针杂交后可选用比色或化学发光法检测。基本原理通过偶联反应和显色反应两步来实现。首先，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，然后再进行酶促显色反应。有三类显色反应可用于结果的观察。① 酶促显色法。最常用的酶是碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，如图8-7所示；
② 荧光法。荧光素标记的探针杂交后可通过荧光显微镜观察或者免疫组织化学法检测，主要用于原位杂交检测，最常用的为FITC；
③ 化学发光法。在化学反应中释放的能量以光的形式发射出来，某些底物在被碱性磷酸酶水解时会发光从而形成检测信号。发射光线的强度反映了酶的活性，从而体现了杂交分析的量。尼龙膜和硝酸纤维素薄膜均可用化学发光检测。

图8-7 酶促显色法原理 第二节 常见的核酸分子杂交技术 核酸分子杂交反应可以在溶液内进行（液相杂交），亦可在固相支持物，如硝酸纤维素、尼龙膜上进行（固相杂交），固相杂交根据诊断目的或杂交方式不同又可分为Southern杂交（Southern blot）、Northern杂交（Northern blot）、斑点杂交（dot blot）、原位杂交（in situ hybridization，ISH）、等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele specific oligonucleotide，ASO）、菌落杂交、反向点杂交等。所谓印迹杂交是指将凝胶中分离的生物大分子转移或者直接放在固定化介质上，然后与液相中核酸分子探针进行杂交，并加以监测分析的过程。不同的核酸分子杂交技术的用途不同，见表8-2。

表8-2 核酸分子的类型及用途 杂交类型 检测目的与范围 Southern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子 Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子 菌落杂交 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子 斑点杂交 检测固定在膜上的DNA或RNA分子 原位杂交 检测细胞涂片或组织切片中的DNA或RNA分子 一、原位杂交 原位杂交是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸按照碱基互补配对原则进行特异性杂交，然后应用组织化学或免疫组织化学法在显微镜下进行细胞内定位、定性和定量分析的方法。该技术的基本原理是根据被检测靶DNA的序列设计其互补的探针，经过变性后的单链靶DNA可以与已标记的探针分子在低温下复性，形成靶DNA与探针的杂交体，如图8-8所示。该技术可以在反应过程中保持细胞形态，甚至是单个染色体的形态完整，因此通常被用于正常或异常染色体的基因定位、组织或细胞内基因表达位点的确定、转录水平的分析以及病毒或病原体感染的检测等。该技术在遗传学、病理学、基因诊断学等领域得到了广泛的应用。

图8-8 原位杂交示意图 目前应用最多的原位杂交是荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），其探针应用荧光素直接或间接标记。荧光素（如异硫氰酸荧光素）直接标记的探针杂交后可使用荧光扫描共聚焦显微镜直接观察，该方法操作简单，但是灵敏度差；
用生物素或地高辛间接标记的探针杂交后的结果检则，具有直观、快速、高灵敏度的特点，被广泛应用。FISH技术还被广泛应用于比较基因组杂交、基因图谱的绘制、生殖医学和病原微生物的检测等。

知识拓展：
原位杂交技术的发明 1969年，Pardue和John等两个研究小组发明了原位杂交技术（ISH），采用放射性标记DNA或28S-rRNA；

1988年，Giovannoni等首次将ISH引入细菌学研究，使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物；

1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。于是，利用同位素标记核酸探针，可以确定基因在细胞和组织的定位，从而创造了原位杂交技术。随着分子生物学的发展，在经典的原位杂交技术上，又出现了更多简洁、快速的新技术。

二、斑点杂交 斑点杂交是将变性后的DNA或RNA待测样品直接点样于硝酸纤维素薄膜或其他固相载体上，然后加入过量的标记核酸探针进行杂交。该技术优点是在同一张膜上可以同时进行多个样品的检测，样品用量少，方法简便、快速、灵敏，缺点是不能鉴定靶核酸分子的大小、特异性低。斑点杂交技术可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和定量分析。

三、Southern杂交 Southern杂交是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，对目的DNA进行检测分析的过程。

Southern杂交的基本操作过程如下：① 分离提取DNA样品，并经限制性内切酶酶切；
②将酶切后的样品DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离，将电泳分离后的DNA样品凝胶放入变性液中，使DNA变性；
③　取出含变性DNA的凝胶，将硝酸纤维素薄膜或其他固相支持物放在其上，通过电转移、毛细管虹吸作用或利用真空抽滤作用等方法等使凝胶内的DNA转移到支持物上，再高温烘烤使DNA牢固的吸附在固相支持物上。在转移过程中，要保持各DNA条带之间的位置不变；
④ 加入核酸探针，让其与固相支持物上的DNA片段杂交；
⑤ 冲洗固相支持物，以除去未杂交的探针；
⑥ 检测杂交信号。如图8-9所示。

图8-9 Southren 杂交 Southern杂交技术主要用于检测基因组DNA，如基因组DNA中特定基因的定性定量分析、外源基因的转入、内源基因的突变等。

四、Northern杂交 Northern杂交是一种将RNA分子从电泳凝胶中转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，然后对RNA加以检测分析的方法。

Northern杂交的基本过程与Southern杂交相似，只是转移的核酸分子是RNA。因为RNA分子较小，转移前无需限制性内切酶消化，且电泳分离之前需要甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，有利于与硝酸纤维素薄膜结合。Northern杂交与Southern杂交比较如图8-10所示。

图8-10 Southern杂交和Northern杂交比较 Northern杂交目前主要应用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织细胞中同一基因的表达情况。Northern杂交检测mRNA的表达水平灵敏度较PCR差，但其特异性高，假阳性率低，仍不失一种可靠的检测mRNA表达水平的方法。

知识拓展：
Southern杂交与Northern杂交名称的由来 Southern杂交是由英国牛津大学著名生物化学家埃德温•迈勒•萨瑟恩(Edwin Mellor Southern)于1975年在爱丁堡大学任职时发明的。该技术是E.M.Southern首创的， 因此将此项技术命名为Southern印迹杂交。该技术是对基因组DNA特定序列进行定位的方法。Northern杂交由斯坦福大学的George Stark教授于1975年发明， 因为其杂交原理与Edwin Mellor Southern教授发明的Southern杂交原理相似，实验过程也相似，所以取了一个类似的名字叫Northern杂交。

其原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳， 继而按照同Southern 杂交相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

五、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一种是相应于突变基因序列设计的寡核苷酸探针（M），一种是相应于正常基因碱基序列设计的寡核苷酸探针（N）。用两种探针分别与受检者DNA样品进行分子杂交。可能会出现以下4种情况：① 受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的纯合子；
②受检者DNA既能与M杂交，又能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的杂合子；
③受检者DNA不能与M杂交，但能与N杂交，说明受检者无该种基因突变；
④受检者DNA与M、N均不杂交，提示患者缺陷基因可能是一种新型的基因突变。

第三节 DNA芯片技术 DNA芯片技术是在20世纪末发展起来的一项大规模、高通量的应用核酸杂交技术的新的核酸分析技术，目前已被应用于基因表达分析、基因突变检测、基因诊断、功能基因组的比较研究、基因组作图、新基因的发现等诸多研究领域。

一、DNA芯片技术概述 基因芯片（gene chip）又称DNA芯片、DNA阵列，DNA芯片技术的基本原理是核酸分子杂交。它是指将许多特定的DNA探针有规律的紧密排列固定于单位面积的固相支持物上，形成高密度的DNA微阵列，然后与待测的荧光标记样品进行特异性地杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较分析，从而迅速得出对目的基因的定性和定量分析结果。基因芯片的分类依据不同，分成不同的种类。根据其片基不同分为无机片基芯片（如半导体硅片和玻璃片）和有机合成物片基芯片（如硝酸纤维素薄膜和尼龙膜）；
根据其应用不同又分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片等；
根据其结构不同分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片和基因组芯片等。

二、DNA芯片的设计与制备 DNA芯片的设计原则是保证DNA探针的特异性和准确性，设计内容主要包括DNA探针的特异性设计与芯片DNA的点阵定位。DNA探针的特异性可通过基因文库或DNA的测序结果获得。双链DNA芯片的DNA探针常用PCR扩增产物，所以首先必须保证获得产物序列的准确性。PCR扩增产物序列的准确性可通过设计特异引物、保证引物Tm值一致、扩增片段大小的一致性等实现。芯片DNA的点阵定位往往设计双重或三重重复点阵，另外在其他区域还需增加阴性和阳性对照用于校正。重复点阵可保证结果地可靠性；
阴性对照为不含DNA的空点，作为芯片的背景控制；
阳性对照为定量加入的相应标记DNA，获取的信号用作外标准，用于衡量或校正同一芯片上各不同区域的杂交差异。

DNA芯片主要用于基因表达、转录水平及靶DNA片段中是否存在多态性或点突变的检测。根据芯片的应用目的不同，探针序列设计需要具有针对性。对于表达型芯片探针的设计，需设计出针对基因中的特定区域的多套寡核苷酸探针或cDNA探针，序列主要来源于已知基因的cDNA序列；
对于单核苷酸多态性检测芯片的探针设计，一般采用长移位设计法，按靶序列从头到尾取16～25bp的与靶序列完全互补的寡核苷酸形成探针组合，再设计一组相对应的与靶序列不完全互补的寡核苷酸探针，分别与样品和对照进行杂交，比较杂交信号；
对于特定突变位点探针的设计，测定的变化点应该出现在设计探针的中心，以便得到突变位置及发生变化的检测。

芯片探针载体的选择也是影响芯片技术的关键。常用的固相载体材料主要有玻片、硅片、硝酸纤维素薄膜、尼龙膜、聚丙烯膜等。材料在使用前必须进行活化，以增加载体与探针的结合能力。活化的主要方式是在载体表面涂布多聚赖氨酸或包被氨基硅烷耦联试剂。

常用DNA芯片制备方法主要有直接点样法和原位合成法。① 直接点样法：是指将预先合成好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA通过高速点样机直接点在芯片上，理化方法使之固定。② 原位合成法：指利用4种核苷酸直接在芯片载体上合成所需要的DNA探针，适用于制备寡核苷酸芯片和制备大规模DNA探针芯片。原位合成的方法主要包括：光导原位合成法、原位喷印合成法和分子印章合成法。光导原位合成法是将半导体工业的光蚀刻技术和DNA合成技术结合起来，利用光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光刻掩膜和不断地更换曝光区域，使基片上受光保护的羟基脱保护二活化，加入核苷酸底物后，直接在片基上合成寡核苷酸探针。原位喷印合成法是利用微喷头把DNA合成试剂按一定顺序依次逐层地喷印在基片表面的不同位置上。分子印章合成法是指利用分子印章（硅橡胶模板），根据预先设计的探针矩阵依次准确压印在同一片基上，从而得到高密度的基因芯片。如图8-11所示。在进行芯片制备时，需根据芯片的设计和芯片的用途选择不同的制备方法，以便提高检测结果地准确性。

图8-11 原位合成芯片示意图 三、DNA芯片应用的基本操作 DNA芯片应用的基本操作主要包括：样品制备、杂交反应、杂交信号检测及结果分析。如图8-12所示。

图 8-12 DNA芯片的操作流程 （一）样品制备　 DNA芯片检测样品的制备包括核酸的纯化、扩增与标记。核酸样品为复杂的生物大分子，其提取物常常含有杂质，需要进行纯化。以纯化后的DNA样品作为PCR扩增的模板进行PCR扩增，然后对PCR扩增得到的大量产物进行标记。如果初始样品为总RNA或mRNA时，首先进行RNA的纯化、然后进行RT-PCR扩增，将扩增产物再进行标记。常用的标记方法为荧光标记法，一般使用荧光标记的引物或荧光标记的dNTP，在PCR扩增时将荧光加入到探针中。标记后的样品需要进行再次纯化才能使用，否则会造成荧光背景偏高，影响结果分析。使用的荧光标记物主要有：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate，FITC）、罗丹明（lissamine rhodamine B200，RB200）、六氯-6-甲基荧光素（6-hexachlorofluorescein，HEX）、四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TMR）、羧基荧光素（carboxyfluorescein，FAM）等。

（二）杂交反应　 DNA芯片的杂交反应与传统核酸杂交方法相似。在进行杂交反应之前必须考虑杂交温度、杂交液的组分、杂交的时间、标记样品DNA的浓度、探针DNA的长度、芯片的用途等因素，以提高杂交反应的质量，这直接关系到检测结果的准确性。

（三）杂交信号的检测及结果分析 杂交信号的检测方法要根据标记物的不同进行选择，最常用的是荧光法。荧光信号的检测仪器主要有激光共聚焦芯片扫描仪或电荷偶联装置（charge coupled device，CCD）芯片扫描仪。DNA芯片检测的原理是基于双色荧光探针杂交。该系统将两个不同来源的样品DNA分子用不同的荧光分子（如正常用红色、肿瘤用绿色）进行标记，标记的DNA分子等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的激发光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。呈现绿色荧光的位点代表该基因只在肿瘤组织表达，呈现红色荧光信号的位点代表该基因只在正常组织表达，呈现两种荧光互补色—黄色的位点则表明该基因在两种组织中均有表达。见图8-12。扫描后的芯片图谱需要专门的软件进行分析处理。

四、DNA芯片技术的应用 DNA芯片技术具有自动化运行、样品检测高通量、灵敏度高、检测结果准确度高等独到的优势，已成为医学分子生物学研究领域的一项重要技术。具体应用体现在以下领域：① 生命科学的研究。如基因表达分析、基因型、基因突变和基因多态性分析、基因组比较等；
② 临床疾病的诊断。如遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等诊断，指导用药及治疗方案的确定以及预防医学等；
③ 药物的研发。如药物筛选等。随着研究的深入，DNA芯片技术将会得到更广泛的应用。

（马晓磊 张向阳） 习 题 一、选择题 A型选择题 1．下列可用作核酸探针的分子包括：
A．基因组DNA探针 B．cDNA探针 C．RNA探针 D．寡核苷酸探针 E．以上均是 2．5′末端的DNA探针标记主要依靠的酶是：
A．T4多聚核苷酸激酶 B．末端转移酶 C．AKP D．DNA polⅡ E．DNA pol 3．Southern杂交通常是指：
A．DNA和RNA杂交 B．DNA和DNA杂交 C．RNA和RNA杂交 D．蛋白质和蛋白质杂交 E．DNA和蛋白质杂交 4．检测的靶序列是RNA的技术是：
A．Southern杂交 B．Western杂交 C．Northern杂交 D．Eastern杂交 E．等位基因特异性寡核苷酸杂交 5．将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为：
A．原位杂交 B．斑点杂交 C．Southern杂交 D．Northern杂交 E．Western杂交 6．标记的参与杂交反应的核酸分子称：
A．引物 B．探针 C．dsDNA D．ssDNA E．寡核苷酸分子 7．基因芯片技术的本质是：
A．核酸分子杂交技术 B．蛋白质分子杂交技术 C．聚合酶链反应技术 D．基因重组技术 E．DNA酶切技术 8．以等位基因特异的寡糖苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针接合，则该样本为：
A．正常人 B．杂合体患者 C．纯合体患 D．携带者 E．不能确定 9．核酸保持在细胞或组织切片中经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为：
A．原位杂交 B．RNA杂交 C．斑点杂交 D．菌落杂交 E．DNA杂交 10．在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，称为：
A．杂交 B．预杂交 C．杂交前处理 D．原位杂交 E．封闭 11．荧光原位杂交主要用于：
A．快速确定是否存在目的基因 B．检测的目标是RNA C．用于基因定位分析 D．阳性菌落的筛选 E．蛋白水平的检测 X型选择题 12．标记核酸探针最常用的核素是：
A．32P B．3H C．35S D．125I E．14C 13．下列以用于探针全程标记的方法是：
A．缺口平移标记法 B．随机引物标记法 C．5′末端标记法 D．3′末端标记法 E．PCR标记法 14．影响核酸杂交的因素有：
A．靶DNA分子的浓度 B．靶DNA分子的长度 C．杂交液组分 D．杂交时间 E．杂交温度 15．基因芯片的支持介质可以是：
A．硝酸纤维素薄膜 B．玻璃片 C．尼龙膜 D．琼脂糖凝胶 E．聚丙烯酰胺凝胶 16．下列哪些可以作为核酸探针使用：
A．寡核苷酸 B．单链cDNA C．DNA D．RNA E． mRNA 17．关于核酸探针的描述下列正确的是：
A．可以是DNA B．可以是RNA C．可用放射性标记 D．可用非放射性标记 E．必须是单链核酸 二、思考题 1．简述探针的类型与制备方法。

2．简述常见DNA杂交的类型与原理。  3．简述DNA芯片的制备方法。

4．简述DNA芯片技术的操作流程。

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