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    一株海南菌草“绿洲一号”内生细菌的分离鉴定及其生物学特性研究

    时间：2023-01-10 20:11:04来源：百花范文网本文已影响人

    李望豪，周瑞鹏，许钰滢，赵琪琪，刘 娟，王荣波，叶文雨

    （1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002；
    2.福建农林大学生命科学学院/植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；
    3.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；
    4.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350013）

    【研究意义】菌草可作为灵芝等食、药用菌培养基的成分。海南菌草“绿洲一号”是由国家菌草工程技术研究中心选育出的菌草品种之一。该品种在水土保持，治理盐碱地，抑制病原菌及作为食、药用菌新型培养基原料等方面都有广阔的发展前景［1-5］。“绿洲一号”是菌草中较为重要的品种，明确“绿洲一号”内生细菌的生物学特性及其更深层次的机理，可以为菌草资源利用及其可持续发展提供理论支持，也为植物病原真菌的生物防治及植物促生机理的研究奠定基础。【前人研究进展】植物内生细菌是指可以长期在植物体内生存，且会对植物的生长发育产生一定益生作用的一类细菌［6-9］。目前，从植物组织分离的内生细菌是当今微生物领域研究的一大热点，其主要研究方向为内生细菌的促生能力和拮抗能力。Khanna等［10］从鹰嘴豆（Cicer arietinumL.）中分离出对其枯萎病具有拮抗作用且可促进鹰嘴豆植株生长的菌株；
    曹鹏飞等［11］从杨梅等植物的组织中分离出对杨梅枯萎病病菌拮抗效果良好的内生细菌；
    白洁等［12］从欧李根部分离得到7株内生细菌，均具有一定的溶磷和产IAA 能力，从而对植物产生促生作用；
    钱鑫等［13］从健康的黄瓜植株中分离出对菊苣假单胞菌（Pseudonwnas cichorii）有抑菌作用的内生细菌，该菌具有很好的固氮、溶磷等促生作用，在抵抗病原真菌的同时还可以为黄瓜提供生长所需的微量元素，从而促进黄瓜生长。【本研究切入点】前人对经济作物和粮食作物内生细菌的研究较为深入，近年来也逐渐重视对菌草等植物内生细菌的研究。鉴于“绿洲一号”菌草用途广泛，其内生细菌功能多样，故对其内生细菌进行相关研究。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）可作为微生物杀虫剂，其在植物病虫害防治中起到积极作用，并且近年来得到更深入的研究与应用［14-15］。目前苏云金芽孢杆菌大多是从土壤和部分植物组织中分离得到，而从菌草分离得到苏云金芽孢杆菌的研究鲜有报道。【拟解决的问题】本研究从海南菌草“绿洲一号”分离得到1 株内生细菌，并对其生理生化特性、拮抗病原真菌以及其促生性能等方面展开研究，为植物病原真菌的生物防治及植物促生机理研究提供基础理论。

    1.1 试验材料

    供试植物为海南菌草基地的“绿洲一号”（Juncao“Oasis No.1”），2020 年10 月采其叶片作为内生细菌的分离材料。

    供试病原真菌为稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，Guy11）、香蕉枯萎病菌4 号（Foctropical race4，Foc4），病原真菌均保存在植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室。

    供试培养基包括细菌生长培养基：LB 固（液）体培养基［16］；
    真菌菌丝生长培养基：PDA 培养基［17］；
    生理生化培养基：淀粉水解培养基［18］、明胶培养基［19］、脱脂奶粉培养基、柠檬酸盐利用培养基、酯酶检测培养基、纤维素水解培养基；
    促生性能培养基：有机磷培养基［20］、无机磷培养基［21］、CAS 检测培养基［22］、硅酸盐细菌培养基［23］、King 培养基［24］。

    1.2 试验方法

    1.2.1 内生细菌的分离与纯化 将新鲜叶片用自来水冲洗，洗净后用75%酒精浸泡5 min，然后用无菌水冲洗3 次以上，将最后一次无菌水涂布于LB 培养基中，以确定表面是否消毒彻底。将叶片剪碎后放入研钵，加入无菌水充分研磨，吸取上清液并将上清液稀释至10-1、10-2、10-3倍，然后分别涂布于LB 培养基上。培养1 d 后挑取合适的菌落，纯化3 次后加甘油，以菌液︰甘油为3︰1 的比例对分离纯化得到的内生细菌进行保藏。

    1.2.2 内生细菌拮抗病原真菌的筛选 采取平板对峙法，将提前活化的稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 号切成直径5 mm 的菌饼，菌丝向下接种在培养基中心。再将提前活化16 h 的内生细菌分别添加在距离中心菌饼3.5 cm 处，待对照组病原真菌基本长满平板时记录对照组和试验组病原真菌菌落半径，计算抑菌率：

    1.2.3 内生细菌的分子鉴定 活化内生细菌16 h 后，利用菌液作为模板，采用引物27F 和1492R［25］，PCR 条件及反应体系参考刘彦超等［25］的方法，PCR 产物送至生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与NCBI 数据库中的已知序列进行BLAST 比对，利用 MEGA7.0 软件采用近邻相接法构建出系统发育树。

    1.2.4 内生细菌的生理生化特性分析 将内生细菌活化16 h 后进行生理生化特性鉴定［26-28］，相关试验包括革兰氏染色、柠檬酸盐利用试验、纤维素利用试验、明胶液化试验、酯酶试验、淀粉水解试验、蛋白酶试验和接触酶试验。

    1.2.5 内生细菌的促生能力分析 将内生细菌活化16 h 后进行该菌对植物的促生能力分析［29-32］，相关试验包括溶磷能力鉴定、合成铁载体能力鉴定、降解硅酸盐能力鉴定以及分泌IAA 能力鉴定。

    2.1 内生细菌HLY3-2 的形态学特征

    从海南菌草“绿洲一号”叶片上分离得到1株内生细菌（编号：HLY3-2）。从图1A 可见，HLY3-2 菌落呈红色圆形，边缘规则、表面光滑、湿润、粘稠状，菌落直径为1～2 mm。经革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状（图1B），初步鉴定该内生细菌为芽孢杆菌（Bacillussp.）。

    图1 内生细菌HLY3-2 的形态学特征Fig.1 Morphological characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

    2.2 内生细菌HLY3-2 拮抗病原真菌的筛选

    内生细菌HLY3-2 拮抗病原真菌筛选试验结果表明，该菌对稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 号两种病原真菌均具有一定的抑菌作用（图2）。通过测量对照组病原真菌菌落直径与试验组病原真菌菌落直径，得出内生细菌HLY3-2 的抑菌率分别为 18.45%和30.65%（图3）。

    图2 内生细菌HLY3-2 对病原真菌的拮抗作用Fig.2 Antagonism of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

    图3 内生细菌HLY3-2 对病原真菌的抑制率Fig.3 Inhibition rates of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

    2.3 内生细菌HLY3-2 的分子鉴定

    采用通用引物对菌液进行PCR 扩增，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果（图4A）显示，HLY3-2菌株的16SrDNA 基因片段大小约1 600 bp。测序得到16S rDNA 基因序列后，将序列与NCBI 数据库中的已知序列进行BLAST 比对，将具有同源性高的序列下载，利用MEGA7.0 软件进行同源比对，采用邻近相接法构建系统发育树，结果（图4B）表明，内生细菌HLY3-2 与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）汇在一支且相似度高达到99%，故初步判断该菌为苏云金芽孢杆菌。

    图4 内生细菌HLIY3-2 的分子鉴定Fig.4 Molecular identification of endophytic bacterium HLY3-2

    2.4 内生细菌HLY3-2 的生理生化特性

    在柠檬酸盐利用试验培养基中，菌落周围没有产生变化，说明HLY3-2 菌株无法利用柠檬酸盐（图5A）；
    向纤维素利用试验培养基中加入刚果红后，菌落被冲散且无透明圈产生，表明该菌株不具有利用纤维素的能力，从而导致菌落没有很好地固定在培养基上（图5B）；
    向装有明胶培养基的EP 管中接种菌液，明胶没有液化，故该菌株没有使明胶液化的能力（图5C）；
    菌落在酯酶培养基上没有产生透明晕圈，可见其为不产酯酶菌株（图5D）；
    向接种该菌株且恒温培养3 d 的淀粉培养基中加入碘液，2 min 后菌落周围没有产生透明圈，故其为不产淀粉水解酶菌株（图5E）；
    在奶粉培养基上，菌落周围产生了明显的透明圈，故该菌株可以产生蛋白酶（图5F）；
    向涂有该菌落的载玻片上滴入过氧化氢溶液后，迅速产生大量气泡，有氧气产生，故该菌株可以产生过氧化氢酶（图5G）。

    图5 内生细菌HLIY3-2 的生理生化特性分析Fig.5 The physiological and biochemical characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

    2.5 内生细菌HLY3-2 的促生能力

    在含有机磷和无机磷的培养基上，菌落周围都产生了透明圈，因此HLY3-2 菌株具有溶解有机磷和无机磷的能力（图6A 和图6B）；
    在CAS培养基上，菌落周围培养基没有产生黄色晕圈，故该菌株没有产生铁载体的能力（图6C）；
    在硅酸盐细菌培养基上，菌落周围产生了透明圈，故该菌株可以降解硅酸盐，为植物提供钾、硅等微量元素（图6D）；
    通过标准比色法可知，菌液的发酵液得到的颜色深于50 μg/mL IAA的标准溶液，因此该菌株具有很强的产IAA 能力（图6E）。综上可见，HLY3-2 菌株具有一定的促生能力。

    图6 内生细菌HLY3-2 的促生能力分析Fig.6 Analysis of growth promoting ability of endophytic bacterium HLY3-2

    在菌草内生细菌研究方面，邓振山等［33］从巨菌草植株中共分离得到187 株内生细菌，其中86 株具有分泌IAA 的能力，47 株具有溶磷能力。本研究从海南菌草“绿洲一号”叶片中分离得到的内生细菌HLY3-2 具有类似的生物学性能，经过分子与形态学鉴定，该内生细菌为苏云金芽孢杆菌。该菌株与大多数植物组织中分离得到的内生拮抗促生细菌同为芽孢杆菌属，但并非同一种。“绿洲一号”植株高大、根系发达、抗逆性强、营养丰富，可以为更多内生细菌的生存提供条件，后续仍需进一步验证。

    在促生机理研究方面，张萍等［34］对兰科植物内生细菌进行研究，发现内生细菌可以通过溶解磷元素、钾元素和产生IAA 来促进植物生长。而本研究分离得到的内生细菌HLY3-2 具有溶解无机磷、有机磷及降解硅酸盐的能力，并且可以产生IAA。因此该内生细菌HLY3-2 可为植株提供充足微量元素和生长素，进而促进植物生长，故该菌株具有开发成为促生菌剂的潜力。

    在内生细菌拮抗病原真菌方面，周维等［35］从香蕉中分离出可以对Foc4病原真菌产生拮抗的内生细菌；
    郭垂宝等［36］从龙牙百合磷茎中分离出对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）产生强拮抗作用的内生细菌；
    孙宇晨等［37］从百合的茎分离得到具有促生效应的菌株。以上试验可以证实植物内生细菌不仅对宿主有促生作用，还可以增强宿主对病害的抵御能力。本研究分离得到1 株拮抗内生细菌属于苏云金芽孢杆菌，该菌种的促生、拮抗作用未见报道，因此其可为内生细菌进行生物防治提供新思路和新方法。

    在苏云金芽孢杆菌抗病研究方面，李辉等［38］从疏花水柏枝叶片中筛选出对魔芋软腐病病菌拮抗效果较好的苏云金芽孢杆菌，但是对Foc4和Guy11病原真菌的拮抗作用尚未涉及。而本研究分离得到的苏云金芽孢杆菌对Foc4和Guy11均具有一定的抑菌作用，这可能是由于不同宿主对内生细菌的影响不同，从而产生不同抑菌效果。

    在拮抗病原真菌机理方面，刘洋等［39］从核桃根部筛选出拮抗细菌，并对其拮抗病原真菌机理进行了深入研究，表明内生细菌可以通过分泌多种酶（如蛋白酶、纤维素酶）降解病原真菌或抑制病原真菌的生长与繁殖。但是本研究分离得到的内生细菌在生理生化鉴定时表现出可以产生蛋白酶但无法产生纤维素酶的特性，因此其拮抗病原真菌的机理可能与上述研究不同。这可能是由于不同种属的内生细菌生境不同，拮抗病原真菌的机理也不相同。内生细菌HLY3-2 有望在生物防治、生物农药开发、菌草产业发展，以及促进国家农业健康发展等方面发挥一定作用。

    本研究从海南菌草“绿洲一号”中分离得到内生细菌HLY3-2，经鉴定，该菌株为苏云金芽孢杆菌，具有溶解无机磷、有机磷和降解硅酸盐的能力，而且可以产生IAA，兼具促进植物生长的能力。此外，该菌株可以产生蛋白酶、过氧化氢酶，可以在一定程度上清除植物体内的活性氧，利于植物健康生长。内生细菌HLY3-2 对病原真菌Foc4和Guy11具有一定拮抗作用。因此本研究分离得到的苏云金芽孢杆菌可以促进植物生长和抑制病原真菌，为多功能生物菌肥［40］及生防菌的应用提供理论依据。

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