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    4,种方法对肠道致病菌的核酸提取效率比较

    时间：2023-01-14 15:20:07来源：百花范文网本文已影响人

    徐 颖 张 瑾 滕新栋 张 娟 孙燕茹 梁 洁 徐翮飞 杜建森青岛国际旅行卫生保健中心（山东，青岛，266000）

    腹泻性肠道致病菌主要包括沙门氏菌、大肠O157：H7、志贺氏菌、副溶血弧菌等，是严重危害人类健康的主要因素。中国2009 年-2011 年从9 个口岸监测采集79 例旅行者腹泻样本，其中57.52%是由沙门氏菌感染所致，4.35%由副溶血弧菌感染所致。在全世界范围内，大肠埃希菌感染占旅行者腹泻的40%-70%，志贺氏菌在世界范围内也相当常见。肠道致病菌的传统检测技术已经越来越不能满足人们的要求，随着肠道致病菌检测技术的不断发展，分子生物学技术因具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点，已被广泛应用于各类肠道致病菌的检测中［1］。而肠道致病菌的快速检测技术成为了国内外关注和研究的热点之一。

    DNA 提取是肠道病原菌分子生物学检测技术的基础和关键技术环节之一，所提取的DNA 的含量和质量不仅影响到检测的速度，也影响着检测的特异性和灵敏性。不同方法对不同类型病原菌的提取效率存在很大差异。细菌DNA 提取的方法有很多，本研究对比了水煮法、碱液加热裂解法、Chelex-100 提取法、商品试剂盒DNA 提取法4 种方法对志贺氏菌、出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）、沙门氏菌基因组DNA 的提取效果，并用PCR 扩增产物进行验证核酸提取效率，比较4 种方法的提取效率和灵敏度，选出一种简单、快速、适合大规模提取肠道致病菌核酸的方法，为进一步进行肠道致病菌分子检测研究提供基础。

    1.1 菌种及来源

    沙门氏菌标准菌株、志贺氏菌标准菌株、出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）标准菌株均来自青岛海关技术中心实验室保存菌株。

    1.2 主要试剂

    PCR 反 应 试 剂、DNA Marker、TAE 缓 冲 液、Loading Buffer、琼脂糖、蛋白酶K、细菌核酸提取试剂盒等均购自上海生工，Chelex-100 购自SIGMA 公司，NaOH（分析纯）为上海化学试剂厂产品，营养琼脂购自北京陆桥，引物由上海生工合成。

    1.3 方法

    1.3.1 标准菌液配制

    将沙门氏菌标准菌株、志贺氏菌标准菌株、出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）标准菌株分别在固体培养基上划线分离，用接菌环从固体培养基上挑取单个菌落，加入1 mL 生理盐水中混匀，用浊度仪记录浊度，根据麦氏比浊法用生理盐水调整菌液浊度为0.5 麦氏标准，细菌浓度约1×108-1×101CFU/mL的原始菌液。

    1.3.2 引物

    沙门氏菌的引物序列：Fsal：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’，Rsal：5’-GAGTTACTGAACCAA-CAGCT-3’，目标扩增片段长度为526 bp。志贺氏菌的引物序列：Fshig：5’-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3’，Rshig：5’-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3’，目标扩增片段长度为629 bp［2］。出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）的引物序列：F157：5’-TTCAAACAGAGGACCATC-3’，R157：5’-CCCAGCCACTAAGTATTG-3’，目标扩增片段长度为636 bp［3］。

    1.4 DNA 提取方法

    1.4.1 水煮法

    取配置好的菌液1 mL，12 000 r/min 离心10 min，弃上清。加入150 μL 纯水中，混匀，100 ℃煮沸15 min，10 00 0 r/min 离心5 min，上清液即为DNA［4］。

    1.4.2 碱液加热裂解法

    取配制好的菌液1 mL，12 000 r/min 离心10 min，弃上清。加入20 mmol/L 的NaOH 溶液100 μL，混匀，煮沸10 min，置于4 ℃冰箱中30 min，12 000 r/min离心10 min，上清液即为DNA。

    1.4.3 Chelex-100 提取法

    取配置好的菌液1 mL，12 000r/min 离心10 min，弃上清。加入200 μL 5%的Chexlex-100，加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，56 ℃下孵育20 min，然后放置在沸水浴中8 min，置于4 ℃冰箱中30 min，12 000 r/min 离心10 min，上清液即为DNA。

    1.4.4 商品试剂盒DNA 提取法

    使用生工细菌核酸提取试剂盒，操作过程依据说明书步骤进行。

    1.5 基因组DNA 检测

    采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组DNA，上样量为3 μL，3-5 V/cm 恒压电泳20-40 min。

    1.6 PCR 扩增及产物分析

    1.6.1 PCR 反应体系

    10×Buffer 5.5 μL，dNTP 1 μL，引物浓度20 μmol/L各1μL；
    模板3 μL；
    Taq DNA 聚合酶0.5 μL；
    ddH2O 13 μL［2］。

    1.6.2 PCR 反应条件

    94 ℃3 min；
    94 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，30 次循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

    1.6.3 产物分析1.8%-2%浓度的琼脂糖凝胶，上样量为5 μL，3-5 V/cm 恒压电泳20-40 min，结果记录保存。

    1.7 碱液加热裂解法提取的DNA 特异性检测

    按碱液加热裂解法要求提取沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的基因组DNA，分别用沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的特异引物进行PCR 扩增及产物分析。

    1.8 碱液加热裂解法灵敏度检测

    将沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的原始菌液，用生理盐水10 倍梯度稀释至1×108-1×101CFU/mL。对8 个梯度的菌液按碱液加热裂解法要求提取DNA，DNA 分别进行PCR 扩增及产物分析。

    2.1 4 种方法提取效果

    用水煮法、碱液加热裂解法、Chelex-100 提取法、商品试剂盒DNA 提取法同时提取沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的标准菌株的基因组DNA，提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。商品试剂盒DNA 提取法提取的基因组DNA 条带清晰且大小片段均有，Chelex-100 提取法条带最明亮但是集中在小片段，碱液加热裂解法片段有明显的拖尾和弥散，水煮法有时不能显示明显的条带。

    图1 4 种方法提取的DNA 电泳结果

    2.2 PCR 扩增结果

    4 种方法分别提取到的沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 DNA 进行PCR 扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2-4。除水煮法外，其他方法获得的扩增产物条带较淡，其余方法获得的扩增产物条带均清晰明亮。

    图2 4 种方法提取沙门氏菌DNA 的PCR 扩增产物的电泳结果

    2.3 碱液加热裂解法特异性检测

    分别用沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的特异引物扩增沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 的基因组DNA，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图5，每种引物均能扩增出各自菌株相应的特异性条带，且条带清晰、单一、明亮，说明碱液加热裂解法获得的基因组DNA 可以满足细菌检测的特异性要求。

    图3 4 种方法提取志贺氏菌DNA 的PCR 扩增产物的电泳结果

    图4 4 种方法提取O157：H7 DNA 的PCR 扩增产物的电泳结果

    图5 碱液加热裂解法提取志贺氏菌、O157：H7、沙门氏菌DNA 的特异性PCR 扩增产物的电泳结果

    2.4 碱液加热裂解法灵敏度检测

    对沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7 1×108-1×101CFU/mL 8 个浓度梯度的菌液分别提取DNA，再分别进行PCR 扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图6-8。3 株细菌结果均显示，在细菌浓度为1×102CFU/mL 时，碱液加热裂解法提取得到的基因组DNA 可以被有效检出。

    图6 梯度浓度的沙门氏菌核酸的PCR 扩增产物的电泳结果

    图7 梯度浓度的志贺氏菌核酸的PCR 扩增产物的电泳结果

    图8 梯度浓度的O157：H7 的PCR 扩增产物的电泳结果

    目前肠道致病菌的基因组DNA 提取方法除了传统的酚氯仿法以外，可以粗略的分为4 类，包括改良DNA 提取法、Chelex-100 提取法、加热煮沸法和试剂盒提取法［1］。传统的酚氯仿提取法和改良方法费时费力，且需要使用酚类物质，有一定的毒性，大量使用有害健康、污染环境，不适合规模化、常规化使用。加热煮沸法利用高温破碎细菌，并使蛋白质变性而收集DNA，方法简单、快速、成本低，但是DNA 纯度在很大程度上会受到样本种类的影响，产物中会含有大量的蛋白质等杂质［1］。Chelex-100 提取法是一种聚苯乙烯基体离子交换树脂，该树脂悬液可以在碱性、100 ℃下破碎细胞并使蛋白质变性，从而释放DNA。Chelex-100 法可螯合金属离子，在煮沸的过程中保护DNA 并且减少抑制PCR 反应的物质［1］，操作简单，提取时间短，但是提取的DNA 浓度和纯度不如商品试剂盒法，且提取的核酸保存时间短，只能用于短期检测，核酸的重复性不稳定，不能满足一线需求。试剂盒提取法获得的DNA 纯度、浓度都相对比较高且质量稳定，但是试剂盒价格昂贵，在实际的现场和口岸实验室检测中，对成本的限制较大，同时操作比较繁琐，耗费人工太多，不适用于大规模样本的提取［5］。碱液裂解法是一种简单的细菌基因组DNA 提取方法，其原理是在强碱性和一定温度下能迅速破碎细胞膜和核膜，使核酸酶变性并释放DNA。虽然此方法获得的DNA 浓度和纯度不如试剂盒法，但是能够满足PCR 的扩增反应，既能减少试剂的使用，又可以在短时间内完成对样本的有效提取，具有简便、高效、快速和成本低的特点，特别适合同时处理大量样本的口岸一线实验室使用，为高效提取肠道致病菌DNA 提供了一个参考依据。

    本研究选择水煮法、碱液加热裂解法、Chelex-100 提取法、商品DNA 提取法分别提取3 株肠道病原菌基因组DNA。经PCR 验证，4 种方法中，水煮法成本最低且效率最低；
    商品试剂盒DNA 提取法效率最高但成本最高；
    Chelex-100 法获得的小片段最多，核酸易降解；
    碱液加热裂解法相对成本低、操作快、稳定性好、重复性好，获得的核酸能够满足肠道致病菌检测的特异性要求，核酸提取的灵敏度达到1×102CFU/mL。以碱液加热裂解法作为基础，研究在短时间内获得大量的、高效的细菌基因组DNA的提取方法，以满足口岸一线的快速通关、准确检测的要求，有着重要的指导意义。

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