犬黑皮质素受体-4突变体D298N真核表达载体的构建及其在MDCK细胞中的表达
宋立先,刘春红, 王占青,高 蓉,徐学振
(滨州医学院烟台附院,山东烟台 264100)
黑皮质素受体系统由5个密切相关的G蛋白偶联受体组成(MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R)。这些受体参与包括人类在内的多细胞动物许多重要的生物学过程[1]。研究发现,黑皮质素途径在体重调控中起着重要作用,下丘脑黑皮质素信号的增强导致食物摄入减少和能量消耗增加。单基因肥胖伴MC4R功能障碍与能量平衡调节密切相关。此外,MC4R基因突变与单基因肥胖和普通肥胖均有显著相关。MC4R基因突变与脂肪量和肥胖相关(FTO)基因的相互作用显著增加肥胖风险,尤其是青少年[2]。据文献报道,在美国有近12 800名肥胖患者与MC4R的缺陷有关[3]。
研究发现,有超过15亿的成人和儿童面临肥胖的困扰,肥胖已经作为公共健康问题受到人们的广泛关注,严重威胁人类健康[4]。全球疾病负担小组估计,2015年BMI值升高导致400万人死亡,其中2/3的人死于心血管疾病(CVD)[5]。肥胖与2型糖尿病的关系早已被人们所认识,并清楚地解释了许多国家2型糖尿病的高患病率。许多肥胖高危患者的特征是代谢和心血管危险因素并存[6]。众所周知,过度肥胖对流感易感性增加,包括近年在全世界范围流行的新型冠状病毒,对人类的危害堪称是灾难性的。人们通常认为,饮食结构不恰当和缺乏运动是导致肥胖的主要原因,但是有些人即使是健康的生活方式,仍然会面临肥胖的困扰,因为导致肥胖的原因除了生活方式,还有基因因素参与[7]。有学者在对UK生物银行的0.5亿份样本进行筛查,发现了61个MC4R突变体,通过分析发现,均与BMI、肥胖相关代谢性心肌病密切相关[8]。因此,迫切需要深入探究MC4R突变导致的肥胖。
MC4R是一个有996个碱基配对的七次跨膜受体,定位染色体18Q21.3上,主要分布于下丘脑[7]。犬被认为是研究人类疾病和包括肥胖在内的功能失调机制的理想生物医学模型[9]。犬MC4R基因由编码332个氨基酸的单一外显子组成,定位在1号染色体上,在各物种之间存在高度同源性[10]。为了探讨MC4R突变和肥胖之间的关系,笔者成功构建了犬 D298N突变体的真核表达载体,后将其导入MDCK细胞内,旨在为进一步探讨MC4R突变引起的蛋白功能变化提供信息,同时也为人类肥胖的基因治疗提供科研数据。
1.1 材料
1.1.1质粒、菌株及细胞系。带His标签的pcDNA3.1载体、DH5α、PMD18-T Vector、MDCK细胞。
1.1.2主要试剂。Beagle犬新鲜血液;
聚合酶rTaqDNA、X-Gal、异丙基硫代半乳糖苷、限制性内切酶(XhoⅠ和BamHI)、DNA Marker、T4-DNA 连接酶、RNA PCR提取试剂盒;
Trizol Reagent、培养基、Anti-myc 抗体;
G418抗生素、FuGENE HD 转染试剂盒;
胎牛血清等。
1.2 方法
1.2.1引物设计。根据GenBank犬MC4R基因,设计引物序列:上游引物A,5′-CGGGATCCGCCAGGATGAACTCCACCCTTCAGC-3′;
中间引物B,5′-ATGAGAGGGTTGATGATGGAG-3′;
中间引物C,5′-CTCCATCATCAACCCTCTCAT-3′;
下游引物D,5′-CCGCTCGAGGTATCTGCTAGACAAGTCAC-3′。引物AB扩增基因长度为115 bp,引物 CD扩增基因长度为902 bp,引物AD扩增基因长度为1 019 bp。
1.2.2提取犬血DNA,扩增D298N突变体基因PCR。
(1)以引物AB、CD进行PCR反应获得基因片段,分别命名为产物AB、CD。扩增完毕取目的产物20 μL,用凝胶电泳进行检测,然后将凝胶进行回收、纯化,取2 μL进行电泳检测。
(2)以引物AB、CD产物为模板,用引物A、D进行PCR反应获得突变体的DNA片段。扩增完毕取目的产物20 μL,用凝胶电泳进行检测,然后将凝胶进行回收、纯化,取2 μL进行电泳检测。
1.2.3获得的DNA片段进行TA克隆、测序。将突变体D298N的DNA片段连接到pMD18-T载体,命名pMD18-T-cMC4R-D298N,转化到DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选,提取质粒,用BamHI、XhoI进行酶切鉴定,筛选阳性质粒送测序,并与犬MC4R基因序列进行比较。
1.2.4重组真核表达载体构建、测序。用BamHI、XhoI将TA克隆阳性质粒和带His标签的pcDNA3.1真核表达载体进行双酶切、电泳,回收目的片段。用T4 DNA连接酶将带His标签的pcDNA3.1真核表达载体和MC4R片段在16 ℃条件下14 h进行连接,将产物转化到DH5α细胞,用抗生素平板筛选,挑取单克隆菌落鉴定。测序正确后扩大培养,提取质粒DNA。
1.2.5将基因转染到MDCK细胞。将处于对数生长期的MDCK细胞重悬在培养基中,接种细胞,培养24 h,使细胞融合率达75%,把空质粒及重组质粒转染到MDCK细胞内。转染24 h后,继续培养1~2 h,收集细胞。
1.2.6用RT-PCR方法检测基因的表达。转染3 d后,提取未转染细胞、空载体转染细胞、重组体转染细胞的总RNA,进行凝胶电泳检测。用RNA PCR 试剂盒进行RNA反转录。用cDNA做模板,引物A和D进行PCR反应。取20 μL PCR产物,用凝胶电泳检测。
1.2.7用Western blot方法检测蛋白的表达。转染3 d后,用EDTA-胰酶对未转染的细胞、空载体转染细胞、重组体转染细胞进行消化,并提取蛋白质,将蛋白质进行定量检测(分光光度计),然后灌胶、点样、电泳、转膜、封闭,加入His抗体,孵育过夜,与羊抗鼠二抗反应、显色。
2.1 犬的基因组DNA条带用Beagle犬的新鲜全血提取DNA,结果见图1。
图1 犬基因组DNA 1%琼脂糖凝胶分离结果
2.2 犬突变体D298N-MC4R目的片段电泳结果用overlap PCR技术首先扩增115和902 bp 2个片段,再以这2个扩增得到的片段为模板,扩增D298N-cMC4R目的片段,扩增产物约1 000 bp(图2) 。
注:1.犬MC4R 115 bp目的产物;
2.犬MC4R 902 bp目的产物;
3.D298N-cMC4R目的产物;
M.DNA Marker 100 bp
2.3 载体pMD18-T-cMC4R-D298的酶切、测序载体pMD18-T的分子量约2.7 kb,扩增PCR产物约1.0 kb,预测pMD18-T-cMC4R-D298N 的大小约为3.7 kb,提取pMD18-T-cMC4R-D298N 酶切、凝胶电泳回收产物(图3)。测序结果重组表达质粒2处碱基不同,碱基T(777位)→C,碱基G(892)→A(引入的突变位点)。
注:1.pMD18-T-cMC4R-D298N 3 700 bp目的产物;
2.pMD18-T 的2 700 bp条带和犬cMC4R-D298N的1 000 bp目的产物;
M.DNA Marker
2.4 重组体酶切、测序pcDNA3.1-myc-His/A分子量约5.5 kb,PCR扩增产物大小约1 000 bp,可以预测pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R的大小6.5 kb,提取的重组体酶切、凝胶电泳回收产物见图4。测序结果同T—A克隆结果见图5,第298位的天冬氨酸变成天冬酰胺,表明成功构建带突变位点的目的载体。
注:1.pcDNA3.1- myc-His/A-cMC4R重组体;2.pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经Xho I/BamH 酶切产物;M.100~6000 bp DNA分子量对照
图5 犬MC4R-D298N测序结果
2.5 重组体转染MDCK细胞、RT-PCR检测目的基因表达将重组表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N转染入MDCK细胞(图6)培养3 d,提取细胞总RNA并检测,结果见图7。用RT-PCR进行反转录,凝胶电泳结果见图8。从图8可见,空载体转染细胞组、未转染细胞组在1 000 bp处无条带,表明无目的基因表达;
转染重组体细胞组在约1 000 bp处有亮带,表明目的基因成功表达。
注:1.100倍光镜下未转染细胞;
2.100倍光镜下转染3 d后细胞Note:1.The cells without transfection(100×); 2.The cells were transfected with recombinant plasmid after 3 days(100×)
注:1.转染重组体MDCK细胞总RNA;2.转染空载体MDCK细胞总RNA;3.未转染MDCK细胞总RNA
注:1.转染重组体的MDCK细胞RT-PCR结果;2.转染空载体的MDCK细胞RT-PCR结果;
3.未转染的MDCK细胞RT-PCR结果;
M.100 bp DNA 分子量对照
2.6 Western blot检测蛋白表达犬的MC4R基因由332个氨基酸组成,编码蛋白的分子量为36.9 kD。载体融合标签分子量大小约为3 kD,重组体表达的融合蛋白预期大小约为40 kD。Western blot检测蛋白表达结果见图9,可见融合蛋白在40 kD处显示亮带,空载体和未转染组处无亮带,原因为myc基因作为癌基因,细胞本身也有少量表达,因此空载体和未转染细胞组在40 kD处有暗带。
注:A,1.D298N重组体转染细胞组;
2.空载体转染细胞组;
3.转染野生型重组体细胞组;4.未转染细胞组。B,Beta actin 内参
随着肥胖病例逐年上升,迫切需要找到一种能调节体重和食欲的治疗方法。MC4R是新疗法的一个有吸引力的潜在靶点,MC4R被激活后,MC4R调节能量平衡并减少脂肪生成。同时可以识别多种细胞外刺激物,包括小分子、离子、光子、肽和蛋白质,并将刺激物穿过不渗透的膜屏障传递到细胞内区域,从而影响细胞功能的变化。信号通过蛋白质相互作用和激活事件的级联传递,从而引起细胞功能的细胞内生化介质(如第二信使)水平的变化,从而调节多种生理功能。MC4R调节脂肪组织的形成和能量平衡,被认为是新型肥胖治疗的单基因靶点[11]。
MC4R作为瘦素-黑素皮质素途径的一部分,在下丘脑体重调节和能量消耗中起着关键作用。MC4R突变可导致各种MC4R信号通路发生截然不同的变化,并突出了受体突变综合表征的重要性,是单基因肥胖最常见的原因。迄今为止,在肥胖患者中发现的许多突变在体外系统的过度表达中具有功能特征,其中大部分缺少Gs信号途径[12]。近年来,有对牛、鸡、猪、犬的MC4R基因的相关研究,其中研究较多的为猪和犬。黑皮质素受体所有亚型中位于第298位的Asp298的基因序列高度保守[13]。有文献报道,在猪MC4R基因298位氨基酸突变与猪背膘的肥厚呈相关性[14],而犬的该位点是否存在突变及突变后对蛋白功能是否有影响,目前尚鲜见文献报道。然而,今后要想深入研究蛋白功能,载体构建即是第一步工作。
笔者所在课题组曾在前期研究中成功构建犬MC4R-D90N突变体的真核表达载体,并在融合蛋白中成功表达[15]。目前国内有关犬MC4R-D298N氨基酸突变的研究较少,基于此,笔者构建了突变体MC4R-D298N重组真核表达载体,第298位的天冬氨酸变成天冬酰胺,后转染到犬的细胞中并获得成功表达。更多突变位点的发现,尤其是高度保守区域氨基酸突变能否导致蛋白功能变化为进一步探索肥胖的原因提供了更多信息。针对肥胖患者饮食调控的治疗过程中,手术治疗并未在长期临床效果中获益,更加强调了MC4R激动剂药物治疗的重要性,且只有通过基因筛查后才可以评估患者是否适合手术治疗。因此,针对治疗肥胖患者的药物研发更加重要。筛选导致肥胖的危险基因,当前不仅是为了研究常规治疗肥胖药物,甚至可为儿科内分泌学筛选导致肥胖的基因提供指导意见[16]。因此,可以通过基因突变位点的筛查,对存在MC4R基因突变的儿童进行前期干预,包括饮食、运动及药物干预。综上所述,该研究为MC4R基因突变引起蛋白功能变化、MC4R与配体结合后2个信号传导通路之间联系机制提供了前期科研基础,同时为临床上研发治疗肥胖药物及从儿童期预防肥胖的前期干预提供了科研数据。
猜你喜欢 突变体产物引物 水稻胚胎和胚乳双缺陷突变体eed1的表型与遗传分析作物学报(2022年2期)2022-11-06甘蔗褐锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立中国糖料(2022年3期)2022-07-04甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价中国农学通报(2022年12期)2022-06-01水稻细长秆突变体sr10的鉴定与基因定位作物学报(2022年8期)2022-05-29玉米品种德美亚多重SSR-PCR系统的建立及应用中国糖料(2022年2期)2022-04-06华中农业大学番茄团队揭示番茄果实颜色形成的新机制蔬菜(2021年7期)2021-11-27孤独是现代产物,了解其历史或有助抗疫克艰 精读英语文摘(2020年7期)2020-09-21有关PCR扩增过程中的疑虑与剖析中学生物学(2019年7期)2019-10-17美联储加息的产物研究今日财富(2017年32期)2017-10-19- 范文大全
- 说说大全
- 学习资料
- 语录
- 生肖
- 解梦
- 十二星座
-
主题党日活动交流发言8篇
主题党日活动交流发言8篇主题党日活动交流发言篇13月13日,东城区党史学习教育动员大会召开。市委
【活动总结】 日期:2022-12-23
-
2022年4月主题党日活动记录范文15篇
2022年4月主题党日活动记录范文15篇2022年4月主题党日活动记录范文篇1一个崇尚阅读的民族,必然精神饱满、意气风发、活力四射。习近平总书记强调:“学习
【活动总结】 日期:2022-08-01
-
家乡赋|最美的家乡赋
家乡赋 孙传志 今安康市,白河双丰镇,吾之家乡也。三环沃土,山水环抱。其北依山,山系五岭,山
【调研报告】 日期:2020-04-01
-
【人教版1-6年级数学上册知识点精编】1-6年级数学人教版教材
人教版二年级数学上册知识点汇总第一单元长度单位一、米和厘米1、测量物体的长度时,要用统一的标准去测量
【调研报告】 日期:2020-11-08
-
党支部1-12月全年主题党日活动计划表
2022年党支部主题党日活动计划表序号活动时间活动方式活动内容12022年1月专题学习研讨集中观看2022年新年贺词,积极开展学习研讨交流。组织生活会组织党员认真对照党章...
【活动总结】 日期:2022-10-14
-
2022年2月份主题党日活动记录5篇
2022年2月份主题党日活动记录5篇2022年2月份主题党日活动记录篇1尊敬的党组织:在今年的开学初,本人积极参加教研室组织的教研活动,在学校教研员的指
【活动总结】 日期:2022-08-12
-
2023年平安校园建设方案13篇
平安校园建设方案“平安校园”创建工作,我们幼儿园全体教职员工一直把它当作头等大事来抓。领导高度重视,以“平安校园”创建活动为抓手,建立和规范校园安全工作机制
【规章制度】 日期:2023-11-02
-
医院最佳主题党日活动11篇
医院最佳主题党日活动11篇医院最佳主题党日活动篇1 医院最佳主题党日活动篇2为隆重纪念中国共产党成立100周年,进一步巩固党的群众路线教育实践活动成果,切实
【活动总结】 日期:2022-10-29
-
主题党日活动记录202210篇
主题党日活动记录202210篇主题党日活动记录2022篇12021年是中国共产党成立100周年,为广泛开展爱国主义宣传教育,铭记党的历史,讴歌党的光辉历程,
【活动总结】 日期:2022-08-02
-
南京大屠杀国家公祭日悼念文案句子11篇
南京大屠杀国家公祭日悼念文案精选句子1、惟有民魂是值得宝贵的,惟有他发扬起来,中国才有真进步。——鲁迅2、我爱我的祖国,爱我的人民,离开了它,离开了他们,我
【企划文案】 日期:2023-10-20
-
正式的晚宴邀请函 公司晚宴邀请函
尊敬的先生 女士: 我公司谨定于xxxx年xx月xx日xx:xx在xxxx店隆重举行xx市xx届xxxx晚宴(宴会地址:xx区xx路xxxx) 敬请届时光临!xxxxxx集团股份有限公司xxxx有限公司敬邀xxxx年xx月xx日
【简历资料】 日期:2019-08-03
-
《国行公祭,为佑世界和平》课文原文阅读_国行公祭为佑世界和平每段段意
国行公祭,为佑世界和平钟声“国行公祭,法立典章。铸兹宝鼎,祀我国殇。”侵华日军南京大屠杀遇难同胞纪念
【简历资料】 日期:2020-11-28
-
一年级新学期目标简短_一年级学生新学期打算
新学期到了,我是一年级下册的小学生了。 上课的时候,我要认真学习,不做小动作,认真听讲。我要认真学习,天天向上,努力学习,耳朵要听老师讲课,眼睛要瞪得大大的看老...
【简历资料】 日期:2019-10-26
-
[信访复查复核制度作用探讨]信访复查复核有用吗
作为我国特有的一项制度,信访制度的出现并长期存在不是偶然的,虽然一些法学专家认为信访制度具有“人治”
【职场指南】 日期:2020-02-16
-
[党员干部2019年主题教育个人问题检视清单及整改措施2篇] 党员干部
2019年主题教育问题检视清单及整改措施根据主题教育领导小组办公室《关于认真做好主题教育检视问题整改
【求职简历】 日期:2019-11-08
-
红旗颂朗诵稿原文【《红旗颂》朗诵词】
《红旗颂》朗诵词 女:晴空万里,红旗飘扬, 六十载风云,我们昂首阔步。 男:六十个春秋,
【职场指南】 日期:2020-02-16
-
网络维护工作内容_(精华)国家开放大学电大专科《网络系统管理与维护》形考任务1答案
国家开放大学电大专科《网络系统管理与维护》形考任务1答案形考任务1理解上网行为管理软件的功能【实训目
【职场指南】 日期:2020-07-17
-
党委会与局长办公会的区别_局长办公会制度
为进一步加强xxx局工作的规范化、制度化建设,提高行政效能,规范议事程序,特制定本制度。一、会议形式1、局长办公会议由局长、副局长参加。由局长召集和主持。根据工作需要...
【求职简历】 日期:2019-07-30
-
如何凝心聚力谋发展【坚定信心谋发展凝心聚力促跨越】
当前,清河正处于在苏北实现赶超跨越基础上全面腾飞的战略机遇期,处于在全市率先实现全面小康基础上率先实
【简历资料】 日期:2020-03-17
-
《铁拳砸碎“黑警伞”》警示教育片观后感
影片深刻剖析了广西北海市公安局海西派出所原所长张枭杰蜕变堕落的轨迹。观看警示教育片后,做为一名党员教
【简历资料】 日期:2020-08-17
-
在2022级家长会上的讲话【完整版】
下面是小编为大家整理的在2020级家长会上的讲话【完整版】文章
【其他范文】 日期:2022-08-29
-
2022《苦难鸡》读后感范本500字
当前位置:>>>2021-10-03今天,我读了《苦难的鸡》这篇文章,心里百感交集。这是一篇描写一只鸡历经磨难的文章。它第一次磨难来自我们家来了客人,热情好客的为了款待客人,便...
【其他范文】 日期:2022-09-27
-
vbse行政助理工作总结 xx年5月行政助理试用期转正工作总结
xx年5月行政助理试用期转正工作总结撰写人:___________日期:___________xx年
【节日庆典】 日期:2021-01-11
-
商务会议主持人串词8篇
商务会议主持人串词8篇商务会议主持人串词篇1尊敬的各位来宾、各位家长、各位小朋友,大家晚上好!这
【其他范文】 日期:2022-12-20
-
[2020年人社局党组书记抓基层党建工作述职报告]
2020年人社局党组书记抓基层党建工作述职报告2020年以来,在区委的正确领导下,我和局党组班子坚持
【评语寄语】 日期:2020-11-11
-
“司马迁线”与中国历史
王使臻在古代中国的苍茫大地上,隐藏着一条神秘的线。它既与自然地理、气候、人口有关,也与文化、民族、经
【其他范文】 日期:2022-12-29
-
2022年落实党管意识形态学习会交流发言(人大机关党委)(完整)
下面是小编为大家整理的2022年落实党管意识形态学习会交流发言(人大机关党委)
【其他范文】 日期:2022-08-21
-
2022年度在新任职领导干部集体谈话会上的讲话
在新任职领导干部集体谈话会上的讲话1月16日上午,我市召开新任职领导干部集体谈话会。会上宣布了全市新提拔和沟通调整干
【其他范文】 日期:2022-10-29
-
学校老师要廉洁自律廉政课(2022年)
廉洁(1974年-2022年3月28日),中国香港人,本科毕业于中国人民大学经济学专业,拥有达特茅斯学院管理塔克商学院的MBA学位。曾任春华资本集团合伙人,这是一家专注于中国的私...
【其他范文】 日期:2023-01-03
-
黏合剂ST309改善纬编针织面料纬斜
姚春婵,张翊翔,张劲峰,魏乾阳,孙月平(1 绍兴孚亨纺织科技有限公司,浙江绍兴312030;2 绍兴
【其他范文】 日期:2023-02-21
-
理论中心组学习总体国家安全观发言材料9篇
理论中心组学习总体国家安全观发言材料9篇理论中心组学习总体国家安全观发言材料篇1(八)深入学习贯彻中央以及省的重要会议和文件精神深入学习贯彻年度内中央以
【发言稿】 日期:2022-08-04
-
军转座谈会交流发言4篇
军转座谈会交流发言4篇军转座谈会交流发言篇1大家好,我叫贺丽,2015届选调生,来自康定市委组织部,现在省委编办跟班学习。今天,非常荣幸向大家汇报我的学习收
【发言稿】 日期:2022-10-27
-
12岁生日小寿星发言4篇
12岁生日小寿星发言4篇12岁生日小寿星发言篇1各位来宾、各位朋友:大家好!今天,我们欢聚在这里,共同庆祝**十二周岁生日。首先,我代表**的父母以
【发言稿】 日期:2022-07-31
-
党内警告处分表态发言14篇
党内警告处分表态发言14篇党内警告处分表态发言篇1尊敬的各位领导、同事们:大家上午好!刚才会上宣布了党委关于我任职的决定,我首先衷心感谢党委的信任和
【发言稿】 日期:2022-09-13
-
党内警告处分党员讨论发言3篇
党内警告处分党员讨论发言3篇党内警告处分党员讨论发言篇1大家好!作为新时期的一名大学生,认真学习、深刻领会、全面贯彻省党代会精神,是当前和今后一个时期重
【发言稿】 日期:2022-08-07
-
廉政大会总结发言稿7篇
廉政大会总结发言稿7篇廉政大会总结发言稿篇1各位领导,同志们:根据会议安排,我就党风廉政建设工作做表态发言,不妥之处,请批评指正。一、提高认识,切实
【发言稿】 日期:2022-10-30
-
被约谈的表态发言8篇
被约谈的表态发言8篇被约谈的表态发言篇1各位领导、各位党员大家好:这天我能站在鲜红的党旗下,
【发言稿】 日期:2022-12-24
-
破冰提能大讨论个人发言4篇
破冰提能大讨论个人发言4篇破冰提能大讨论个人发言篇1党史学习教育开展以来,我坚持读原著、学原文、悟原理。今天,根据会议安排,现在我就“学史明理”主题谈几点个
【发言稿】 日期:2022-10-09
-
巡察整改专题民主生活会总结发言8篇
巡察整改专题民主生活会总结发言8篇巡察整改专题民主生活会总结发言篇1按照区委统一部署和纪监委、巡察办关于召开党史学习教育专题组织生活会的工作安排,近期我紧贴
【发言稿】 日期:2022-10-12
-
纪委书记工作表态发言4篇
纪委书记工作表态发言4篇纪委书记工作表态发言篇1在镇党委政府正确领导下,在全村干部和群众的共同努力下,紧紧围绕建设社会主义新农村工作为重点,尽职尽责,与时俱
【发言稿】 日期:2022-09-30
-
学习周永开先进事迹心得体会3篇
学习周永开先进事迹心得体会【一】通过学习周永开老先生先进事迹后,结合自己工作思考,感慨万千。同样作为
【格言】 日期:2021-04-10
-
最满意的三项工作200字【最新党办公务员副主任提拔考察个人三年思想工作总结报告】
党办公务员个人三年工作总结近三年来,本人在组织、领导的关心指导和同事们的团结协作下,尽快完成主角的转
【格言】 日期:2021-02-26
-
XX老干局推进党建与业务深度融合发展工作情况调研报告:党建调研报告
XX老干局推进党建与业务深度融合 发展工作情况的调研报告 党建工作与业务工作融合发展始终是一个充满生
【成语大全】 日期:2020-08-28
-
中国共产党第三代中央领导集体的卓越贡献
中国共产党第三代中央领导集体的卓越贡献 --------------继往开来铸就辉煌 【摘要】改
【成语大全】 日期:2020-03-20
-
信息技术2.0能力点 [全国中小学教师信息技术应用能力提升工程试题题库及参考答案「精编」]
全国中小学教师信息技术应用能力提升工程试题题库及答案(复习资料)一、判断题题库(A为正确,B为错误)
【格言】 日期:2020-11-17
-
党建工作运行机制内容有哪些_构建基层党建工作运行机制探讨
党的基层组织是党在社会基层组织中的战斗堡垒,是党的全部工作和战斗力的基础。加强和改进县级以下各类党的
【经典阅读】 日期:2020-01-22
-
电大现代教育原理_最新国家开放大学电大《现代教育原理》形考任务2试题及答案
最新国家开放大学电大《现代教育原理》形考任务2试题及答案形考任务二一、多项选择题(共17道试题,共3
【成语大全】 日期:2020-07-20
-
集合推理_七,推理与集合
七推理与集合1 期中考试数学成绩出来了,三个好朋友分别考了88分,92分,95分。他们分别考了多少分
【名人名言】 日期:2020-12-18
-
基层党务工作基本内容_党建基本工作有哪些
党建基本工作有哪些(一) 基层党建工作包括哪些内容 选择了大学生村官这条路,你就与农村基层党
【名人名言】 日期:2020-08-06
-
[人生赠言]城隍庙人生赠言注释
人之相惜惜于品,人之相敬敬于德,人之相交交于情,人之相随随于义,人之相拥拥于礼,人之相信信于诚,人之相伴伴于爱! 人生的确很累,看你如何品味,每天多寻欢乐,烦...
【格言】 日期:2019-07-14
-
关于三农工作重要论述心得体会3篇
关于三农工作重要论述心得体会3篇关于三农工作重要论述心得体会篇1习近平总书记指出:“建设现代化国家离不开农业农村现代化,要继续巩固脱贫攻坚成果,扎实推进乡村
【学习心得体会】 日期:2022-10-29
-
【福生庄隧道坍塌处理方案】 福生庄隧道在哪里
(呼和浩特铁路局大包电气化改造工程指挥部,内蒙古呼和浩特010050)摘要:文章介绍了福生庄隧道
【学习心得体会】 日期:2020-03-05
-
五个一百工程阅读心得体会13篇
五个一百工程阅读心得体会13篇五个一百工程阅读心得体会篇1凡益之道,与时偕行。在全国网络安全和信
【学习心得体会】 日期:2022-12-07
-
城管系统警示教育心得体会9篇
城管系统警示教育心得体会9篇城管系统警示教育心得体会篇1各党支部要召开多种形式的庆七一座谈会,组织广大党员进行座谈,回顾党的光辉历程,畅谈党的丰功伟绩,
【学习心得体会】 日期:2022-10-09
-
发展对象培训主要内容10篇
发展对象培训主要内容10篇发展对象培训主要内容篇1怀着无比激动的心情,我有幸参加了__新区区委党校20__年第四期(区级机关)党员发展对象培训班。这次的学习
【培训心得体会】 日期:2022-09-24
-
扶眉战役纪念馆心得体会11篇
扶眉战役纪念馆心得体会11篇扶眉战役纪念馆心得体会篇1有那么一段历史,低诉着血和泪的故事,慢慢地,随岁月老去;有那么一群人,放弃了闲逸的人生,辗转奔波中
【学习心得体会】 日期:2022-08-03
-
凝聚三种力量发展全过程人民民主心得体会12篇
凝聚三种力量发展全过程人民民主心得体会12篇凝聚三种力量发展全过程人民民主心得体会篇1新民主主义革命是指在帝国主义和无产阶级革命时代,殖民地半殖民地国家中的
【学习心得体会】 日期:2022-08-31
-
2022年全国检察长会议心得7篇
2022年全国检察长会议心得7篇2022年全国检察长会议心得篇1眼睛是心灵上的窗户,我们通过眼睛才能看到世间万物,才能看到眼前这美好的一切。拥有一双明亮的眼
【学习心得体会】 日期:2022-10-31
-
全面从严治党的心得体会800字7篇
全面从严治党的心得体会800字7篇全面从严治党的心得体会800字篇1中国特色社会主义是我们党领导
【学习心得体会】 日期:2022-12-14
-
教师全国两会精神学习专题研讨交流材料6篇
教师全国两会精神学习专题研讨交流材料6篇教师全国两会精神学习专题研讨交流材料篇1通过对两会精神深入系统的学习,作为新一代的青年人,更应该严格要求自己,贯彻落
【教师心得体会】 日期:2022-08-11
-
2024年主题教育民主生活会批评与自我批评意见(38条)(范文推荐)
2023年主题教育民主生活会六个方面个人检视、相互批评意见:1 理论学习系统性不强。学习习近平新时代中国特色社会主义思想不深不透,泛泛而学的时候多,深学细照的时候少,特...
【邓小平理论】 日期:2024-03-19
-
2024年交流发言:强化思想理论武装,增强奋进力量(完整)
习近平总书记指出:“一个民族要走在时代前列,就一刻不能没有理论思维,一刻不能没有思想指引。”党的十八大以来,伴随着新时代中国特色社会主义思想在实践中形成发展的历程...
【三个代表】 日期:2024-03-19
-
2024年度镇年度县乡人大代表述职评议活动总结
xx镇20xx年县乡人大代表述职评议活动总结为响应县级人大常委会关于开展县乡两级人大代表述职评议活动,进一步激发代表履职活力,加强代表与人民群众的联系,提高依法履职水平...
【马克思主义】 日期:2024-03-19
-
“千万工程”经验学习体会(研讨材料)
“千万工程”是总书记在浙江工作时亲自谋划、亲自部署、亲自推动的一项重大决策,也是习近平新时代中国特色社会主义思想在之江大地的生动实践。20年来,“千万工程”先后经历...
【三个代表】 日期:2024-03-19
-
2024年在市政协机关工作总结会议上讲话
同志们:刚才,XX同志对市政协机关20XX年工作进行了很好的总结,很精炼,很到位,可以感受到去年机关工作确实可圈可点。XX同志宣读了表彰决定,机关优秀人员代表、先进集体代...
【邓小平理论】 日期:2024-03-18
-
在全区防汛防涝动员暨河长制工作推进会上讲话提纲【完整版】
区长,各位领导,同志们:汛期已经来临,我区城区防涝工作面临强大考验,形势不容乐观。年初,区城区防涝排渍指挥部已经召开专题调度会,修订完善应急预案,建立网格化管理机...
【马克思主义】 日期:2024-03-18
-
2024年镇作风整治工作实施方案(完整文档)
XX镇作风整治工作实施方案为深入贯彻落实党的二十大精神及省市区委深化作风建设的最新要求,突出重点推进干部效能提升,坚持不懈推动作风整治工作纵深发展,根据《关于印发《2...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
-
2024市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案【优秀范文】
xx市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案为持续优化法治化营商环境,激发市场主体活力和社会创造力,规范行政执法行为,创新行政执法方式,提升行政执法质效,着力解...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
-
2024年度关于开展新一轮思想状况摸底排查工作通知(完整)
关于开展新一轮思想状况摸底排查工作的通知为深入贯彻落实关于各地开展干部职工思想状况大摸底大排查情况上的批示要求和改革教育第二次调度会议精神,有针对性做好队伍教育管...
【三个代表】 日期:2024-03-18
-
2024年公路养护中心主任典型事迹材料(完整文档)
“中心的工作就是心中的事业”——公路养护中心主任典型事迹材料**,男,1976年6月出生,1993年参加工作,2000年4月调入**区交通运输局工作,大学本科学历,中共党员,现任**...
【马克思主义】 日期:2024-03-17