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    circ_0016788靶向调控miR-1200抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

    时间：2023-03-25 10:00:06来源：百花范文网本文已影响人

    于海东 杨海明 马存凯 郭应兴

    (青海大学附属医院介入诊疗科，青海 西宁 810000)

    肝细胞癌是全球最常见的癌症，其死亡率高，近年来，分子靶向疗法已经在临床上用于治疗包括肝癌在内的多种癌症，更具选择性和特异性，因此研发出更多旨在靶向特定途径的靶向药物对肝细胞癌的临床治疗具有重要意义〔1,2〕。环状核糖核酸(circRNA)在人类癌症的发生中起重要作用，circRNA表达的改变与肝癌的发生、侵袭和转移有关，有作为诊断和预后生物标志物的潜在价值〔3〕。研究报道在肝癌组织和细胞系中circ_0016788被上调；
    circ_0016788沉默可通过miR-486/细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)途径抑制肝细胞癌体外细胞的增殖、侵袭，并促进细胞凋亡〔4〕。circ_0016788高表达与较短的总生存期相关，其具有潜在的生物标志物的作用，可协助外科肝癌患者进行个性化治疗，肿瘤治疗和预后监测〔5〕。然而circ_0016788影响肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制尚未完全清楚。本实验通过在线预测软件预测发现circ_0016788和miR-1200存在互补结合位点。且研究报道RGMB-AS1通过海绵miR-1200促进同源异型盒基因(HOX)B2表达，从而促进神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力〔6〕。circ-0001785通过使miR-1200海绵化以上调HOXB2表达来调节骨肉瘤的发病机制〔7〕。说明长链非编码RNA(lncRNA)和circRNA均可通过靶向调控miR-1200的表达影响肿瘤的发生发展。因此，本实验旨在研究circ_0016788是否可通过调控miR-1200抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

    1.1临床资料 选取2018年1月至2020年6月在青海大学附属医院接受肝切除术治疗的肝癌患者9例，收集患者手术切除癌组织及癌旁组织。所有患者临床及病理资料完整，且签署知情同意书。

    1.2材料 肝癌细胞MHCC97购自上海冠导生物工程有限公司；
    实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒购自美国Biovision公司；
    四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；
    凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；
    双荧光素酶活性检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；
    RPMI1640培养基购自上海谷研实业有限公司；
    Transwell小室购自美国Corning公司。

    1.3细胞转染与分组 将肝癌细胞MHCC97接种至RPMI1640培养基进行常规培养，待细胞长至对数生长期，将circ_0016788干扰载体质粒si-circ_0016788及其阴性对照si-NC分别转染至细胞内，记为si-circ_0016788组、si-NC组；
    将si-circ_0016788与miR-1200抑制剂anti-miR-1200及其阴性对照anti-miR-NC分别共转染至MHCC97细胞内，记为si-circ_0016788+anti-miR-1200组和si-circ_0016788+anti-miR-NC组。

    1.4RT-qPCR检测癌组织及癌旁组织circ_0016788和miR-1200表达水平 提取癌组织及癌旁组织中细胞总RNA，逆转录得到cDNA进行PCR扩增。miR-1200以U6为内参，circ_0016788以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算其相对表达量。其中circ_0016788上游引物：5′-CAGTTTATGATTGCCG TCCTCC-3′，下游：5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′；
    miR-1200上游引物：5′-ACACT CCAGCTGGGCT CCTGAGCCATTCTG-3′，下游：5′-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGCTCA-3′；
    GAPDH上游引物：5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′，下游：5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′；
    U6上游引物：5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′，下游：5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

    1.5circ_0016788对细胞增殖活性的影响检测 将对数生长期肝癌细胞MHCC97制成细胞悬液后接种至96孔板，于CO2孵育箱常规培养24 h，在96孔板内加入20 μl MTT溶液继续培养4 h，每孔中再加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)于摇床上振荡10 min充分反应，通过多功能酶标仪于450 nm波长下检测其吸光度(OD)值。

    1.6Western印迹检测蛋白表达 将对数生长期肝癌细胞MHCC9裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度后进行电泳分离，电泳结束后将凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在凝胶中加入封闭液37℃封闭2 h，加入一抗4℃孵育24 h；
    次日加入相应二抗37℃孵育1 h，采用ImageJ软件对各蛋白条带灰度值进行分析。

    1.7Transwell检测细胞迁移、侵袭 侵袭实验前需要预先在Transwell小室上层铺设基质胶，迁移实验无需铺胶，其余实验步骤一致。收集对数生长期肝癌细胞MHCC9接种至24孔板，加入无血清培养基孵育12 h后弃去培养基，胰酶消化后通过无血清培养将其液制成至1×105个/ml的单细胞悬液，Transwell小室上层加入150 μl/孔肝癌细胞MHCC9，下层加入600 μl/孔培养基于CO2孵育箱孵育24 h，多聚甲醇固定15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加结晶紫染色20 min，再次用PBS冲洗至背景清晰后于荧光显微镜下拍照，计数穿膜细胞。

    1.8流式细胞术检测细胞凋亡 将各组对数生长期肝癌细胞MHCC9接种至96孔板培养48 h，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶制成单细胞悬液。加PBS冲洗细胞后，重悬于结合缓冲液中并制成1.0×106个/ml的单细胞悬液。加入10 μl的膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)染液和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，充分混匀后4℃避光孵育20 min；
    上机检测细胞凋亡率。

    1.9circ_0016788和miR-1200的靶向关系验证 构建circ_0016788野生型(WT-circ_0016788)和circ_0016788突变型(MUT-circ_0016788)荧光素酶表达载体，将上述载体与miR-1200过表达质粒(miR-1200 mimics)、阴性对照质粒(miR-NC)共转染至肝癌细胞MHCC97中，通过双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

    1.10统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验和单因素方差分析。

    2.1肝癌组织circ_0016788和miR-1200表达水平 circ_0016788在肝癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，miR-1200表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

    表1 肝癌组织circ_0016788和miR-1200表达水平

    2.2抑制circ_0016788表达降低肝癌MHCC97细胞增殖活性 与si-NC组相比，si-circ_0016788组肝癌MHCC97细胞增殖活性及circ_0016788、CyclinD1表达水平显著降低(P<0.05)，p21表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、表2。

    2.3抑制circ_0016788表达抑制肝癌MHCC97细胞迁移、侵袭 与si-NC组相比，si-circ_0016788组肝癌MHCC97细胞迁移、侵袭细胞数及MMP-2、MMP-9表达水平显著降低(P<0.05)。见表2、图2、图3。

    图1 两组CyclinD1、p21蛋白表达

    表2 抑制circ_0016788表达降低肝癌MHCC97细胞增殖活性及迁移、侵袭能力

    2.4抑制circ_0016788表达促进肝癌MHCC97细胞凋亡 与si-NC组比，si-circ_0016788组肝癌MHCC97细胞凋亡率及Bax表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。见图4、表3。

    图2 两组MMP-2、MMP-9蛋白表达

    图3 抑制circ_0016788表达抑制肝癌MHCC97细胞迁移侵袭能力(结晶紫染色，×200)

    图4 抑制circ_0016788表达促进肝癌MHCC97细胞凋亡

    表3 抑制circ_0016788表达促进肝癌MHCC97细胞凋亡

    2.5circ_0016788靶向调控miR-1200的表达 circ_0016788的序列中包含与miR-1200的结合位点(图5)。实验结果显示，与共转染WT-circ_0016788和miR-NC的细胞相比，共转染WT-circ_0016788和miR-1200的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而共转染MUT-circ_0016788与miR-1200细胞的荧光素酶活性与共转染MUT-circ_0016788和miR-NC的细胞相比无显著差异(P>0.05)。见表5。

    2.6miR-1200的下调逆转了抑制circ_0016788对肝癌MHCC97细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 与si-circ_0016788+anti-miR-NC组相比，si-circ_0016788+anti-miR-1200组肝癌MHCC97细胞活性及迁移、侵袭细胞数显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率降低(P<0.05)；
    miR-1200、p21、Bax表达水平显著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)。见图6、图7、表5、表6、图8。

    图5 circ_0016788与miR-1200互补结合位点

    表5 细胞荧光素酶活性

    图6 肝癌MHCC97细胞迁移、侵袭能力(结晶紫染色，×200)

    图7 细胞凋亡流式图

    表5 miR-1200的下调逆转了抑制circ_0016788对肝癌MHCC97细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

    表6 miR-1200的下调逆转了抑制circ_0016788对肝癌MHCC97细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响

    1～4:si-NC组，si-circ_0016788组，si-circ_0016788+anti-miR-NC组，si-circ_0016788+anti-miR-1200组

    越来越多的分子靶向药物已用于治疗晚期肝癌，但是，因为肿瘤的异质性和复杂的细胞信号转导，单靶标治疗结果不尽如人意，因此提出针对多靶点的联合治疗〔8〕。而深入研究肝癌发病的分子机制，才能寻找更有效的靶点以开发新的靶向药物。研究表明circRNA可通过调控miRNA影响肝癌的进展〔9〕。如circ_0000502通过靶向miR-124促进肝细胞癌转移并抑制细胞凋亡〔10〕。circRNA_103809通过调节miR-377-3p/成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)轴促进肝细胞癌的发展〔11〕。circRNA-104718通过miR-218-5p/TXNDC5可加速肝细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡〔12〕。研究证实，circ_0016788在肝细胞癌组织和细胞系中表达上调，抑制circ_0016788表达可降低肝癌MHCC97细胞的增殖和转移能力，促进其凋亡〔4〕。本实验结果显示，肝癌组织中circ_0016788表达水平升高，而抑制circ_0016788表达可抑制肝癌MHCC97细胞增殖、迁移及侵袭，诱导细胞凋亡，与既往研究结果相一致。

    研究表明，miRNA在肝癌的发生发展过程中发挥着重要作用，miR-1179过表达减弱了肝癌细胞的增殖和迁移能力〔13〕。miR-206通过调节cMET表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移，但促进凋亡〔14〕。本实验通过在线预测软件预测显示circ_0016788与miR-1200存在互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果证实circ_0016788可靶向调控miR-1200。有研究报道显示circ_0026359通过靶向miR-1200/DNA聚合酶δ4亚基(POLD4)途径增强胃癌的顺铂耐药性〔15〕。本实验结果提示miR-1200可能参与了肝癌的进展过程。同时抑制miR-1200和circ_0016788表达可促进肝癌MHCC97细胞增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡，说明下调miR-1200表达可逆转抑制circ_0016788对MHCC97细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用。综上，circ_0016788可通过靶向调控miR-1200抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。

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