拟南芥MAX2蛋白功能研究进展

吕天晓,刘琼锐,范甜,周玉萍,田长恩

(广州大学生命科学学院，广东省植物适应性与分子设计重点实验室，广州 510006)

独角金内酯(strigolactone,SLs)是一种丁烯内酯类化合物，近年来被确定为一类新型的植物激素[1–2]。SLs 具有刺激寄生植物种子萌发、促进丛枝菌根真菌与植物共生[3]，抑制植物的地上分枝，调控根系发育等多种重要的生物学功能。SL 途径相关基因的突变，往往会导致植物株型的矮小，并同时伴有多分枝的表型。利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、豌豆(Pisum sativum)、矮牵牛(Petunia hybrida)等不同植物品种作为研究材料，从矮小多枝或多分蘖的突变体植物中先后克隆到了20 多个与SL 途径相关的基因。其中MAX1、MAX3和MAX4为SL 合成途径主要成员，而MAX2(more axillary growth 2)则为信号传导途径的核心因子[4]。由于max2突变体表现出多种明显的发育异常表型，使得MAX2 受到了广泛而深入的研究，其多样化的功能逐步得到揭示，大量的研究表明，MAX2 在多种植物激素信号交叉互作中扮演着重要的角色。本文对MAX2 的蛋白结构、已知功能及相关机理进行了简单的总结和阐述，展示了MAX2 研究进展的概貌，以期为进一步揭示MAX2 作用的分子机制及其在不同激素信号途径中的角色和功能提供理论参考，同时针对作物抵御生物和非生物胁迫的育种改良提供一定的理论指导。

MAX2编码具有693 个氨基酸的F-box蛋白,其中包含1 个F-box 结构域，一段富含18 个亮氨酸残基的重复序列LRR (leucine rich repeat)，以及1 个锌指结构域[5]。在拟南芥中F-box 蛋白是一类拥有700 多个成员的庞大家族，与另外2 个蛋白Skp1 (Sphase kinase-associated protein1)和Cullin 构成SCF(Skp1-cullin- F-box)泛素复合体，其中Skp1 和Cullin是复合体的基本骨架，而F-box 蛋白则根据其C 末端不同的二级结构，如亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)、锌指结构域等来特异地招募不同的蛋白质底物，通过泛素/26S 蛋白酶体系统(UPS,ubiquitin-26S proteasome system)将泛素化修饰的底物蛋白降解[6]。F-box 蛋白的底物往往是某一信号途径的抑制子，被降解后则开启信号通路，因此结合底物的不同，决定了F-box 蛋白功能的不同。而同一F-box 蛋白结合的底物不一定是唯一的，因此可能在植物生长发育，以及对生物和非生物胁迫反应等各个方面均发挥重要的功能[5]。

2.1 MAX2 限制植物的寿命

拟南芥MAX2 最早被发现的功能是延迟叶片衰老。Oh 等[7]从3 万多株EMS 诱变的拟南芥M2代幼苗中筛选到4 株在黑暗诱导下叶片寿命延长的突变体，分别命名为ore1(oresara1)、ore2(oresara2)、ore3(oresara3)和ore9(oresara9)，“oresara”在韩语中是长寿的意思，这里的ORE9 与后来在分枝研究中鉴定的MAX2 为同一蛋白。该课题组对ore9突变体的进一步研究表明，ore9的叶片在年龄依赖的自然衰老和激素调节(ABA、MeJA、乙烯)的衰老过程中都表现出寿命延长的特征。通过图位克隆的方法，ORE9基因编码含有693 个氨基酸的多肽，其中包含1 个F-box 基序和1 段富含18 个亮氨酸的重复序列LRR,第327 个氨基酸突变使编码提前终止,导致其功能的丧失。ORE9 的F-box 基序与植物SCF复合物的组成部分ASK1 (Skp1-like 1)相互作用，这表明ORE9 在拟南芥中通过泛素蛋白酶水解途径降解延缓叶片衰老所需的靶蛋白，从而限制叶片寿命[5]。ore9突变体对过氧化氢等氧化胁迫的耐受力增加，并且这种增强的反应与植物叶片的寿命有关[8]。Yan 等[9]首次验证了水稻中的D3基因(MAX2同源基因)在调控水稻叶片衰老中的作用，与拟南芥max2相似,d3突变体在黑暗诱导的衰老进程和过氧化氢诱导的细胞凋亡中也出现延迟的表型，表明水稻中的D3 蛋白与拟南芥中的ORE9/MAX2 具有相同的功能,可参与调控叶片的衰老和细胞的凋亡。

ORE3/EIN2 (ethylene insensitive 2)和EIN3 是乙烯信号途径重要的响应因子。2016年，Zhang 等[10]报道在MeJA 诱导下，MPK6 (mitogen-activated protein kinase 6)通过直接激活ORE3/EIN2 和EIN3 促进乙烯反应信号基因的表达,同时MPK6 增强细胞核中EIN3 的积累，EIN3 与ORE9启动子结合，并增加ORE9的mRNA 水平,这揭示MeJA 诱导下，包括MPK6-ORE3/EIN2-EIN3-ORE9/MAX2 在内的信号通路对调节叶片衰老的影响。

2.2 MAX2 抑制植物的分枝

Stirnberg 等[11]通过筛选拟南芥突变体库，发现了3 个初级分枝密集的株系max1-1、max2-1和max2-2,除多分枝表型外，3 个株系的叶片形状也受影响,其中max2-1和max2-2株系出现下胚轴和叶柄的伸长。图位克隆表明MAX1和MAX2为2 号染色体上2 个不同的等位基因，其中MAX2与Oh 等[7]克隆到的能够限制拟南芥叶片寿命的ORE9为同一基因，其第581 和585 位氨基酸变异分别导致max2-1和max2-2的异常表型，MAX2 通过控制腋芽分生组织抑制基原细胞的形成，从而抑制拟南芥的分枝。过量表达缺失F-box 结构域的MAX2 蛋白不能恢复max2的突变表型，证明MAX2 调控植物分枝的过程涉及泛素化途径，MAX2 可能通过UPS 系统降解某种能够激活腋芽生成的未知蛋白来抑制分枝的形成[12]。Ishikawa 等[13]分析了5 个植株变矮、分蘖增多的水稻突变体d3、d10、d14、d17和d27株系，认为分蘖矮化突变体在控制分蘖芽休眠以抑制芽活性方面发挥了作用，基于图位克隆的D3基因包含4 个外显子和3 个内含子，具有F-box 结构域和NRR 序列，与拟南芥MAX2/ORE9高度同源，其第154 个氨基酸处插入转座子导致氨基酸序列改变并形成终止子，这表明单子叶和双子叶中控制腋芽活性的机制是保守的。自此之后，D3 控制水稻分蘖的功能得到了广泛深入的研究。

BES1 (bri1-EMS-suppressor 1)是BR 信号通路中的正调节因子，作为下游转录因子直接调节BR 反应基因的表达，Wang 等[14]报道BES1 及其同系物可以与MAX2 相互作用，作为MAX2 的底物被26S蛋白酶系统UPS 降解，同时BES1 及其同系物的表达降低可以显著抑制max2突变体的多分枝表型,表明BES1 是MAX2 的直接靶标并作为SL 信号通路的负调节因子促进拟南芥地上部分枝。

在水稻中，利用1 个对SL 不敏感的矮秆突变体d53克隆到D53基因，该基因编码D14-SCFD3泛素复合体的底物并作为SL信号的阻遏物起作用。用人工合成的独脚金内酯类似物GR24 处理后，D53通过26S 蛋白酶体降解。同时，D53 可以与转录共抑制因子TPR (topless-related protenins)相互作用共同调控水稻的分蘖表型[15–16]。在拟南芥中，3 个D53类似蛋白SMXL6、SMXL7 和SMXL8 (suppressor of more axillary growth2-like 6,7,8)也在控制腋芽分枝方面发挥相似的功能，smxl6smxl7smxl8三突变体抑制max2和SL 缺陷突变体max3的高度分枝表型。外源施用SL 类似物rac-GR24 导致SMXL6,SMXL7和SMXL8 泛素化降解。该过程同样依赖于MAX2与D14 形成的泛素复合体。同时SMLXs 通过转录共抑制子TPR2抑制分枝相关转录因子BRANCHED1的表达，从而调控侧芽生长[17]。研究表明[18]，D3/MAX2 蛋白的C 末端螺旋结构(C-terminal helix,CTH)在SCFD3/MAX2泛素复合体招募D14、泛素化D53/SMXLs 以及后续的蛋白质降解中都发挥着关键的调节作用，利用CRISPR-CAS9 基因编辑去除了CTH的植物，其SL 信号的转导严重受损，这从蛋白质构象的层面解析了MAX2 功能，为科研人员提供了全新的研究思路。

2.3 MAX2 影响幼苗的光形态建成

2007年，通过遗传筛选分离到1 个在连续红光、远红光和蓝光下，下胚轴变长、子叶变小，并对红光和远红光诱导的种子萌发不敏感的T-DNA 突变体pps(pleiotropic photosignaling)。基于图位克隆和候选基因相结合的方法，定位到PPS与MAX2/ORE9为同一个基因，至此已从3 种不同的遗传筛选中分别定位到了相同的基因，可见PPS/MAX2/ORE9功能的多效性，推测在植物整个生命周期的不同发育阶段，MAX2 可能调控多个靶点，以优化植物的生长发育[19]。MAX2 调节GA 和ABA 的生物合成,以优化种子在光照下的萌发，max2种子在萌发反应中对GA 低敏感，对ABA 高敏感。与野生型相比,max2种子中GA 生物合成基因的表达下调，而GA分解代谢基因的表达上调，max2种子中ABA 生物合成和分解代谢基因的表达均上调。用生长素运输抑制剂NPA 处理，max2幼苗中生长素运输的增加有助于下胚轴延长的表型。以上这些表型都仅限于max2调控，而SL 合成途径突变体max1、max3和max4在种子萌发和幼苗去黄化方面没有任何缺陷。因此,MAX2 调节多种激素途径以影响光形态发生[20]。

Wang 等[21]报道，人工合成的SL 类似物GR24 4DO 增强SL 受体DWARF14 (D14)和SMXL2 的互作，而KAR 的替代物GR24ent-5DS 诱导KAR 受体KARRIKIN INSENSITIVE2 (KAI2)与SMAX1 和SMXL2 的互作，2 条信号都引发SMXL2 的泛素化降解。SMXL2 在下胚轴对GR244DO 的反应中至关重要，而在对GR24ent-5DS 的反应中SMXL2 与SMAX1 存在功能的冗余。同时，2 条信号都通过SMXL2 诱导D14-LIKE2 和KAR-UP F-BOX1 的反应，这揭示了SL 和KAR 在调控植物下胚轴伸长中重要的信号交汇机制。

2.4 MAX2 促进种子的萌发

Karrikins 是从植物燃烧后产生的烟中分离得到的一种丁烯内酯类化合物，其结构与SLs 相似，能够刺激种子的萌发，在多个方面影响幼苗的早期发育。Nelson 等[22]利用γ射线辐照拟南芥Ler (landsberg erecta)，从M3 代群体中筛选到7 株对KAR1诱导的种子萌发不敏感的突变体株系，其中2 个突变体kai1-1和kai1-2具有多种相同的表型，包括腋芽分枝增加，花序高度缩短，延迟衰老，叶卷曲和延长的下胚轴，同时kai1-1和kai1-2对KAR1、KAR2及人工合成的独脚金内酯类似物GR24 诱导的种子萌发没有任何反应。这些表型与拟南芥突变体max2/ore9/pps完全相同。对kai1-1和kai1-2突变体中的max2基因进行测序,揭示了2个独特的等位基因出现4 bp 插入和4 bp 缺失，导致编码693 个氨基酸的MAX2 蛋白在第248 和66 个密码子之后发生移码突变，现在分别将这2 个突变体称为max2-7和max2-8。Karrikins 和GR24 在种子萌发、幼苗的光形态建成和早期发育相关基因的表达上具有相同的表型，但不同的是Karrikins 并不能抑制拟南芥和豌豆的分枝，表明SLs 和Karrikins 这2 条不同化学路径的作用机制不完全相同，但2 种信号的传导都需要F-box 蛋白MAX2[22]。Waters 等[23]进一步揭示，D14 蛋白是植物对SL 反应所必需的，而D14旁系同源基因KAI2 (KARIKIN INSENSITIVE 2)则是karrikins 信号所必需的，D14 和KAI2 的表达模式与植物发育不同阶段对SLs 或karrikins 的反应能力一致，2 者同属于α/β水解酶家族成员，结构相似，但d14和kai2突变体却表现出依赖于max2的不同表型，表明MAX2 在2 种信号中发挥不同作用以提高植物对环境的适应性。

Stanga 等[24]通过筛选突变抑制子鉴定了1 个突变体smax1-1max2-1，其能够恢复拟南芥max2种子萌发及苗期光形态建成，但不影响侧根形成、腋芽分枝以及衰老延迟表型，经图位克隆确定smax1(suppressor of MAX2 1)抑制max2突变表型的功能为5 号染色体At5g57710 第292 位氨基酸突变形成终止密码子所致。Zhou 等[16]证实SMAX1 为水稻SL 信号调控分枝表型的底物蛋白D53 在拟南芥中的同源基因。Struk 等[25]通过串联亲和纯化的方法筛选到1 个新的拟南芥MAX2 互作蛋白PAPP5(phytochrome-associated protein phosphatase 5)，其与KAI2 结合调控KAR/KL 介导的次优条件下种子萌发和幼苗发育进程，此外，磷酸肽富集试验表明,PAPP5 可能在体内以不依赖rac-GR24 的方式去磷酸化MAX2，从而控制KAR/KL 相关表型[25]。

2.5 MAX2 介导非生物胁迫反应

max2突变体对干旱、ABA 抑制的种子萌发、NaCl、葡萄糖和甘露醇等非生物胁迫超敏感[4,26],这可能与max2对干旱和ABA 诱导的气孔闭合敏感度降低，以及角质层厚度明显变薄有关。与max2明显不同，独脚金内酯合成途径的突变体max1、max3和max4并不参与这些反应过程，表明这些反应主要不是由SL 信号所介导，而是通过SL 信号传导途径的关键调节因子MAX2 参与到ABA 或其他激素信号的调控中而得以实现的。

水稻D53基因在拟南芥中的同源基因SMXL6/SMXL7/SMXL8参与干旱反应，与野生型相比,smxl6-smxl7smxl8三突变体耐旱性显著增强，失水量降低，角质层变厚,花青素生物合成增加，而且对ABA 诱导的气孔闭合及萌发后的ABA 反应超敏感，这些表型刚好与max2-1突变体相反，进一步证明了ABA和SL 信号通路在调节植物对干旱等非生物胁迫的反应中存在交叉互作，而SMXL6，SMXL7 和SMXL8作为SL 介导的植物分枝信号途径中SCFMAX2泛素复合体的底物蛋白，在ABA 信号传导中同样发挥重要功能[27]。最新的研究表明，拟南芥SMAX1 可以与D14 相互作用，在渗透胁迫的触发下，通过SL 信号途径被降解，从而起到在胁迫条件下保护植物的作用[28]。

2.6 MAX2 增强植物抗病性

Piisilä1 等[29]报道max2突变体对腐生型细菌—肉食果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)敏感性增强，推测这种表型可能与max2的气孔导度增加，对活性氧抗性减弱，以及激素失衡有关。而max2、d14及SL 合成途径的max3和max4突变体对Pseudomonas syringaeDC3000 的反应更加敏感，在应对Pst DC3000的反应中，max2突变体内积累大量的水杨酸，表明SL 并不是防御反应基因表达的主要调节子，MAX2 可能是通过其他未知途径激活SA和ABA 信号共同调控植物的防御反应[30]。与野生型植物相比，max2突变体的内源水杨酸含量和水杨酸反应基因的表达水平较低。在野生型和独脚金内酯生物合成缺陷突变体中，独脚金内酯类似物GR24 能够增强抗病性。在野生型植物接种病原菌之前，GR24 处理并不能诱导防御相关基因的表达；
然而，在感染病原菌后水杨酸反应相关的防御基因被迅速诱导。这表明SLs 在水杨酸介导的植物抗病反应中具有重要影响[31]。

2.7 MAX2 影响根系发育

与野生型(WT)相比，max2-1、max3-11和max4-1突变体侧根密度明显增加，表明内源SLs 负向控制侧根的形成。外源施用10–8mol/L 的GR24，可以降低max3-11和max4-1的侧根密度，表现与WT相近，但GR24 处理并不影响max2-1的侧根数量；
同时GR24 能够促进野生型、max3-11和max4-1根毛的伸长，而同样对max2-1没有影响,这表明MAX2 在SL 介导的根系发育调控中发挥关键的信号传导功能[32]。进一步的研究揭示了3 种植物激素SL、Auxin 和ET 在调控根毛伸长中的相互作用机制，其中SLs 和乙烯通过共同的途径调节根毛伸长，乙烯对SLs 起上位作用，SL 对根毛的影响依赖于乙烯的合成。生长素反应对于SL 信号来讲不是必需的，但生长素增强了根毛对SL 的反应，表明SL和生长素通过不同的途径调节根毛的伸长，并且乙烯在SL 和生长素途径之间形成了交叉互作[33]。但最近的研究证明[34]，先前归因于SL 信号对拟南芥根系发育的大多数影响实际上是由KAI2 信号通路介导的。由于KAI2 和D14 分别被鉴定为Karrikin和SL信号的受体，2条信号途径的功能汇集于MAX2,利用Karrikin和SL合成及信号途径突变体证明,D14和KAI2 共同调节侧根密度，但只有KAI2,而非D14能够调节根毛的发育，不仅如此，KAI2 信号还能调节根的倾斜、卷曲以及根的直径，而这一过程依赖于水稻D53 在拟南芥中的同源蛋白SMXL1 和SMXL2，而被确定为SL 介导的拟南芥分枝信号的底物SMXL6、SMXL7、SMXL8 则可以影响侧根的形成，这表明KAI2 信号通路是拟南芥根毛和根发育的一个重要的调节器，并为研究SL 和Karrikin的激素信号通路如何调节不同表型的分子机理奠定了重要基础。

植物的一生只能固定在一个地方，为了应对生长发育过程中，来自体内、外环境的各种刺激和挑战，植物进化出了完善而精密的激素调控网络，包括Auxin、GA、SA、JA、ABA、ET、CK、BR、SL、Karrikin 等，彼此之间相互协调，相互依赖，共同作用促使植物适应不断变化的环境条件。因此，近年来揭示各种激素间的交叉互作机制，成为植物激素信号调控研究中最重要的研究方向[35]。F-box 蛋白作为泛素-26S 蛋白酶系统UPS 的重要组成成分，通过与不同激素信号中的底物蛋白结合，介导底物的降解，从而在激素调控的多种反应中发挥重要功能[36]。

MAX2 属于含有33 个成员的F-box-LRR 的亚家族，该家族的一些成员已被证明是植物激素信号传导中的重要生长调节因子，包括生长素受体TIR1[37–38]、茉莉酸受体COI1[39–40]和乙烯信号中的EBF1 和EBF2[41–42]。MAX2 分别在衰老、萌发、分枝、光形态建成4 种不同表型的遗传筛选中被鉴定[5,11,19,22],足以证明MAX2 功能的多向性。而随着研究的不断深入，MAX2 更多的功能逐步被鉴定,如影响根系的发育、介导生物和非生物胁迫反应等。与其他F-box 不同，MAX2 在激素反应中的作用机制更为复杂，其功能的响应往往涉及多种不同激素调控途径，如max2的衰老表型与ABA、ET 相关[5,10]，萌发表型与SL、Karrikin、ABA 和GA 相关[4,22–23,43],分枝表型与Auxin、SL和BR相关[14–17,44],光形态建成与Auxin、ABA 和GA 相关[20]，根的发育与SL、Karrikin 相关[32–34]，生物和非生物胁迫与SA、JA 和ABA 相关[4,26,29,31]。MAX2 还能够影响种子的大小及愈伤的形成，可能与细胞分裂素相关[45]。可见MAX2 的重要性在于其对不同激素间交叉互作所发挥的关键作用，而不仅仅是最初认为的是SL 信号或Karrikin 信号的调节因子。

当然这些功能的发挥依赖于对不同信号中底物蛋白的水解，目前的研究仅鉴定了MAX2 在调控分枝表型中的蛋白底物，即SL信号的SMXL6、SMXL7、SMXL8[17]和BR 途径的BES1 及其同源基因[14]，在下胚轴对GR244DO 的反应中起关键调控作用的SMXL2[21]，以及在渗透胁迫的触发下通过SL 信号被降解的SMAX1[28]，而其他功能的底物尚未确定。是已知的这些蛋白同时发挥了不同的功能，还是有其他未知的组分参与了这些过程还有待进一步的发掘与证实，因此识别SCFMAX2的蛋白质靶标是未来研究的一个关键领域，将为全面揭示MAX2 的多种功能及植物激素信号调控网络的作用机理奠定基础，并为农作物的遗传育种提供可靠的理论指导。

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