氰戊菊酯通过诱导mPTP开放干扰小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的机制

胡文慧，姚金玲，李兴元，孔德营

(遵义医科大学 生理学教研室，贵州 遵义 563099)

氰戊菊酯(Fenvalerate，Fen)是一种拟除虫菊酯类杀虫剂，目前广泛应用于农业、林业以及公共卫生领域的病虫害防治，因此造成大气、土壤和水的污染，对人体健康形成潜在危害[1-2]。研究表明，Fen属于环境内分泌干扰物，可通过抑制雄性睾酮(Testosterone，T)合成与分泌阻碍精子发生，具有明显的雄性生殖毒性，但其干扰雄性睾酮合成的机制尚不十分清晰[3]。

雄性体内的睾酮由睾丸间质细胞经一系列酶促反应合成，并受到下丘脑-垂体-睾丸轴的调控。垂体释放的促黄体生成素(LH)与睾丸间质细胞的LH受体结合，激活胞内腺苷酸环化酶(ACs)，催化ATP转化为cAMP，后者通过磷酸化作用激活cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)并调节睾酮合成过程多种关键蛋白和酶的表达[4]。ATP作为cAMP合成的原料，其胞内合成水平决定了cAMP/PKA信号通路的调节能力。而线粒体是ATP合成的主要场所，因此，线粒体的功能与状态决定了睾丸间质细胞的睾酮合成能力。

多项研究结果显示，Fen等杀虫剂引起的雄性睾酮合成障碍与睾丸活性氧(ROS)水平激增关系密切[5-7]。Temkin等[8]研究发现，ROS作为第二信使可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，激活的MAPKs通过介导线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放引起细胞的线粒体损伤。Wang等[9]认为，mPTP的开放过程中，除了ROS之外，Ca2+也是重要的调控信号。基于上述研究，猜测Fen可能通过诱导睾丸间质细胞氧化应激和Ca2+稳态失衡引起细胞mPTP开放从而抑制睾酮的合成。本研究通过建立急性离体染毒实验模型分析Fen干扰小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的分子机制。

1.1 细胞株与细胞培养 小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞株)购自中国科学院上海生命科学研究院。TM3细胞在37 ℃(5% CO2)的细胞培养箱中于DMEM/F12完全培养基中培养。细胞增殖到培养瓶底面70%～80%时进行传代，弃去旧培养基，PBS缓冲液(预热至37 ℃)洗涤细胞2次，胰酶消化，至显微镜下观察细胞全部变圆时，加入DMEM/F12 完全培养基终止消化。移液枪吹打混匀细胞，离心机(1 500 rpm)离心5 min，弃上清。DMEM/F12培养基重悬细胞，接种至新的培养瓶或培养板中。

1.2 主要试剂 DMEM/F12基础培养基购自上海源培生物科技有限公司；
胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和青链霉素混合液购自Hyclone；
氰戊菊酯、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，ROS清除剂)购自Sigma；
人绒毛膜促性腺激素购自上海阿拉丁生物科技有限公司；
BAPTA-AM(胞内Ca2+离子螯合剂)购自MCE；
兔抗β-actin 单克隆抗体、兔抗StAR多克隆抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司；
兔抗3β-HSD单克隆抗体购自SANTA；
兔抗ANT4单克隆抗体、兔抗CyPD单克隆抗体购自Signalway Antibody；
小鼠COX IV单克隆抗体购自上海亚科因生物科技有限公司；
线粒体总蛋白提取试剂盒、钙荧光探针Fluo-4/AM 荧光探针购自Thermo Fisher Scientific；
ROS 检测试剂盒和JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；
细胞周期活性检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；
ELISA试剂盒购自江苏酶免生物科技有限公司；
ATP含量检测试剂盒购自湖南艾方生物科技有限公司。

1.3 主要实验方法

1.3.1 TM3细胞分组与处理 (1)TM3细胞Fen暴露毒性模型的建立：TM3细胞接种于96孔细胞培养板中，密度为1×104个/孔，同时加入10 IU/mL hCG刺激睾酮分泌。依据文献报道[10-11]，在细胞培养基中分别添加终浓度为0(control group)、1、5、25、50 μmol/L 的Fen，各浓度Fen暴露的TM3细胞均分别培养1、12、24 h，CCK-8 法检测细胞活性，ELISA法检测TM3细胞睾酮合成水平，根据细胞活性和细胞睾酮合成水平筛选出的适宜Fen暴露方法。(2)实验分组：根据上述实验结果，同时为明确Fen抑制睾丸间质细胞睾酮合成是否与ROS和Ca2+信号调控的线粒体损伤有关，确定TM3细胞按以下方式处理：对照组(Control group，0 μmol/L Fen)，25 μmol/L Fen暴露组，25 μmol/L Fen + NAC(5 mmol/L)组，25 μmol/L Fen + BAPTA-AM(10 μmol/L)组(NAC和BAPTA-AM分别为ROS清除剂和胞内Ca2+螯合剂，剂量依文献报道确定)，孵育24 h，收集细胞或培养液待测。

1.3.2 CCK-8法检测细胞活性TM3细胞 经上述不同浓度、不同时长Fen暴露后，弃去培养基，每孔加入100 μL的CCK-8 工作液，于37 ℃细胞培养箱中孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD450)，分析细胞活性。

1.3.3 ELISA法检测睾酮(T)及环磷酸腺苷(cAMP)含量 按照试剂盒说明书操作，取等量的各组细胞蛋白提取液，加入对应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，37 ℃孵育30 min，洗板，加底物显色剂，避光孵育10 min，终止液终止反应，酶标仪测定450 nm波长各孔吸光度。绘制标准曲线，计算T和cAMP含量。

1.3.4 比色法测定ATP含量 收集药物处理后的TM3细胞，离心弃上清，加入1 mL提取液，冰浴超声波破碎细胞(冰浴，功率200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次)，4 ℃离心10 min(12 000 rpm)，取上清，按照试剂盒说明书操作，酶标仪记录340 nm波长OD值，根据说明书提供的公式计算ATP含量。

1.3.5 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)水平 将细胞接种于共聚焦皿，药物处理后，吸除培养液，PBS溶液洗涤细胞1次，加入细胞培养液和JC-1染色工作液各1 mL，混匀，37 ℃细胞培养箱中孵育20 min，弃去上清，JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入2 mL细胞培养液。JC-1 在高线粒体膜电位细胞中以多聚体形式存在，显示红色荧光；
在低线粒体膜电位细胞中以单体形式存在，显示绿色荧光。激光共聚焦显微镜检测细胞中JC-1单体(Monomer，激发光490 nm，发射光530 nm，绿光)和多聚体(Aggregate，激发光525 nm，发射光590 nm，红光)含量，ZEN2.3软件分析平均荧光强度。

1.3.6 DFCH-DA荧光探针检测活性氧含量 将细胞接种于共聚焦皿，药物处理后，吸除培养液，PBS溶液洗涤细胞1次，加入1 mL稀释好的 DCFH-DA工作液(探针装载前按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L)，37 ℃细胞培养箱避光孵育30 min，无血清培养液洗涤细胞1～2次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。DCFH在ROS的氧化作用下发出绿色荧光，荧光强度与细胞ROS水平正相关。激光共聚焦显微镜(激发波长488 nm，发射波长525 nm，绿色荧光)检测细胞ROS水平，ZEN2.3软件分析平均荧光强度。

1.3.7 钙荧光探针Fluo-4/AM检测胞内Ca2+浓度 将细胞接种于共聚焦皿，药物处理后，弃去培养液，加入0.02%的Pluronic F-127及Fluo-4/AM(4 μmol/L)荧光探针，37 ℃细胞培养箱避光孵育40 min。胞内Ca2+浓度与Fluo-4/AM荧光强度正相关。激光共聚焦显微镜观察(激发波长494 nm、发射波长525 nm，绿色荧光)，ZEN 2.3软件分析平均荧光强度。

1.3.8 Western blot 检测3β-HSD、StAR、ANT4和CyPD的蛋白水平 各组细胞经不同药物处理后，使用RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，使用线粒体总蛋白提取试剂盒提取线粒体总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭，分别加入兔抗3β-HSD单克隆抗体(1∶500)、兔抗StAR多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗ANT4单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗CyPD单克隆抗体(1∶1 000)和兔抗β-actin单克隆抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，再加入抗兔HRP-IgG(1∶5 000)二抗，室温孵育1 h，ECL法显影，ImageJ 2.30软件分析目标蛋白和内参蛋白的灰度值，计算蛋白相对表达量。

2.1 TM3细胞Fen暴露急性染毒模型的建立 依据Fen急性染毒实验相关报道[10-11]，按浓度梯度分别为0(Control group)、1、5、25、50 μmol/L，时间梯度分别为1、12、24 h，对TM3细胞进行Fen暴露染毒。细胞活性分析实验结果显示，当暴露时长为1～12 h时，各浓度Fen均未影响TM3细胞活力(见图1,P>0.05)，当暴露时长为24 h且Fen浓度为50 μmol/L时，TM3细胞活力下降(见图1,P<0.01)。睾酮浓度检测结果表明，当暴露时长为1～12 h时，各浓度Fen均未影响TM3细胞睾酮合成能力(见图1,P>0.05)，当暴露时长为24 h且Fen浓度为25和50 μmol/L时，TM3细胞睾酮合成能力显著下降(见表1,P<0.05或P<0.01)。以上结果表明，当Fen暴露时长和剂量分别为24 h和25 μmol/L时，TM3细胞睾酮合成已受到干扰，但细胞活性尚未受到影响；
当Fen暴露时长和剂量分别为24 h和50 μmol/L时，TM3细胞睾酮合成和细胞活性均受到显著影响。为排除细胞活性下降对TM3细胞睾酮合成的影响，选择暴露时长和剂量分别为24 h和25 μmol/L用于建立TM3细胞Fen急性染毒实验模型。

A、B、C、D、E分别为0、1、5、25、50 μmol Fen；
F：不同浓度Fen染毒24 h后TM3细胞活性统计结果；
**：与相同暴露时间的0 μmol/L组比较,P<0.01；
n=5。

表1 不同浓度和时间Fen染毒对TM3细胞睾酮合成水平的影响

2.2 TM3细胞处理方法及Fen暴露对TM3细胞睾酮合成的影响 为明确Fen抑制睾丸间质细胞睾酮合成是否与ROS和Ca2+信号调控的线粒体损伤有关，本实验在TM3细胞暴露于Fen的同时，同时孵育ROS清除剂NAC或胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM，结合上述实验结果，TM3细胞按以下方式处理：对照组(Control group，0 μmol/L Fen)，25 μmol/L Fen暴露组，25 μmol/L Fen + NAC(5 mmol/L)组，25 μmol/L Fen + BAPTA-AM(10 μmol/L)组(NAC和BAPTA-AM浓度参考文献报道)，孵育时长为24 h。

实验分析了各组TM3细胞睾酮合成水平。ELISA检测结果表明，与照组比较，25 μmol/L Fen暴露组的TM3细胞睾酮合成水平显著下降(见图2,P<0.01)；
与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞睾酮合成水平显著上升(见图2,P<0.05)。

**：与对照组比较, P<0.01; #：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.05；
n=5。

2.3 Fen暴露后TM3细胞睾酮合成相关蛋白表达水平的变化 Westeron blot结果显示，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的StAR和 3β-HSD表达水平均显著下降(见图3,P<0.01)；
与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的StAR和3β-HSD表达水平均显著升高(见图3,P<0.05)。

A:Control;B:25 μmol Fen;C:25 μmol Fen+NAC;D:25 μmol Fen+BAPTA-AM;**：与对照组比较, P<0.01; #、##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.05、P<0.01；
n = 5。

2.4 Fen暴露对TM3细胞ATP和cAMP含量的影响 实验通过比色法测定细胞ATP含量，ELISA法测定细胞cAMP水平。结果显示，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的ATP和cAMP含量显著下降(见图4，P<0.01)；
与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的ATP和cAMP含量均显著升高(见图4，P<0.01)。

**：与对照组比较, P<0.01; ##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.01；
n=5。

2.5 Fen暴露对TM3细胞胞线粒体膜电位(MMP)的影响 JC-1荧光探针检测结果显示，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的JC-1多聚体(红光)荧光强度明显下降，JC-1单体(绿光)强度明显升高，提示25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞MMP水平下降(见图5，P<0.01)；
相反，与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的MMP水平均显著升高(见图5，P<0.01)。

**：与对照组比较, P<0.01; ##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.01；
n=5。

2.6 Fen暴露后TM3细胞ROS水平的变化 激光共聚焦显微镜检测结果表明，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的DCFH-DA荧光强度明显升高(见图6,P<0.01)，提示Fen暴露使TM3细胞胞内ROS水平升高，Fen诱导了TM3细胞氧化应激；
与之相反，与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的ROS水平均显著降低(见图6，P<0.01)。

A:Control组;B:25 μmol Fen组;C:25 μmol Fen+NAC组;D：25 μmol Fen+BAPTA-AM组;E：各组ROS统计结果；
**：与对照组比较, P<0.01; ##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.01；
n=5，标尺为100 μm。

2.7 Fen暴露后TM3细胞胞内Ca2+水平的变化 Ca2+荧光探针Fluo-4/AM检测结果表明，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的Fluo-4/AM荧光强度明显升高(见图7,P<0.01)，提示Fen暴露使TM3细胞胞浆Ca2+水平升高，Fen诱导了TM3细胞Ca2+超载；
相反，与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的Ca2+水平均显著降低(见图7，P<0.01)。

A:Control组;B:25 μmol Fen组;C:25 μmol Fen+NAC组;D：25 μmolFen+BAPTA-AM组;E：各组钙离子统计结果；
**：与对照组比较, P<0.01; ##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.01；
n=5，标尺为50 μm。

2.8 Fen暴露对TM3细胞线粒体膜通透性转运孔(mPTP)结构成分蛋白ANT4和CyPD表达的影响 实验分析了Fen染毒后TM3细胞mPTP的结构成分蛋白腺嘌呤核苷转位蛋白4(ANT4)和亲环素D(CyPD)的表达水平，Westeron Blot结果表明，与对照组相比，25 μmol/L Fen暴露组TM3细胞的ANT4和CyPD表达水平均显著上升(见图8，P<0.01)；
与25 μmol/L Fen暴露组比较，25 μmol/L Fen+NAC组、25 μmol/L Fen+BAPTA-AM组TM3细胞的ANT4和CyPD的表达水平均显著下降(见图8，P<0.01)。

A:Control;B:25 μmol Fen;C:25 μmol Fen+BAPTA-AM;D:25 μmol Fen+BAPTA-AM**：与对照组比较,P<0.01; ##：与25 μmol/L Fen 比较, P<0.01；
n=5。

流行病学研究表明，目前全球8%～15%的育龄夫妇面临不同程度的生育障碍，其中男方因素约占50%[12]。精液质量下降是男性不育最重要的原因之一。越来越多的证据表明，人类精液质量的大幅度下降很可能是一些环境危险因素影响的结果。我国是农业大国，杀虫剂的生产和使用量逐年上升，污染十分严重，造成的急性中毒以及慢性潜在危害令人担忧[13]。多项调查研究显示，Fen等拟除虫菊酯类杀虫剂在蔬菜、水果和茶叶中均有不同程度的残留，残留量为0.005～1.430 mg/kg[14-16]；
在土壤和水体中，Fen等拟除虫菊酯类杀虫剂的平均残留量为0.0015～0.8843 mg/kg[17-18]。这提示人类已长期暴露于Fen等农药杀虫剂残留的环境之中。由于杀虫剂在人体存在累积效应，人类健康因此受到越来越大的威胁。男性精液质量依赖于雄性激素调控的精子发生，而Fen等多种农药杀虫剂均可影响雄性生殖激素的合成与分泌[19]。因此，明确Fen等杀虫剂干扰雄性生殖激素合成的机制对于寻找一种有效的预处理药物作用新靶点以减少杀虫剂等环境污染物引起的生殖损伤具有重要意义。

睾酮是以胆固醇为原料，先后在睾丸间质细胞的线粒体和滑面内质网内经多种酶催化形成的一种类固醇激素，也是男性体内最重要的生殖激素，睾丸曲细精管内各级生精细胞的分化成熟依赖于高浓度的睾酮环境。在睾丸间质细胞，胆固醇存在于线粒体外部的胆固醇池，脂溶性的胆固醇进人线粒体时，通过线粒体内、外膜之间的亲水间隙存在较大障碍。Bose等[20]研究认为，StAR蛋白可作用于线粒体膜，使线粒体内外膜之间形成脂溶性环境或桥状结构接触点，协助胆固醇通过线粒体内外膜之间的亲水间隙。此外，3β-HSD催化孕烯醇酮转化为孕酮是睾酮合成过程中在滑面内质网进行的首步反应，与睾酮的最终合成水平密切相关[21]。Habotta等[22]研究发现，杀虫剂噻虫嗪暴露引起的雄性大鼠睾酮合成障碍与睾丸间质细胞StAR和3β-HSD的mRNA水平下调有关。本实验结果显示，Fen暴露后，TM3细胞的StAR蛋白和3β-HSD表达水平均显著下降，其睾酮合成能力也随之下降。这些结果提示，Fen等杀虫剂引起的雄性睾酮合成障碍可能与其抑制睾丸间质细胞StAR蛋白和3β-HSD的表达有关。

StAR和3β-HSD等睾酮合成相关蛋白和酶的表达依赖于cAMP/PKA信号通路的调节[23-24]。在cAMP/PKA信号通路中，cAMP起主导作用。由于cAMP以ATP为合成原料，因此，睾丸间质细胞的ATP水平决定了其睾酮合成能力[25]。ATP 主要产生于线粒体氧化呼吸链(又称电子传递链，ETC)的电子传递和氧化磷酸化作用。在线粒体氧化呼吸链，底物脱下的电子沿着ETC 流动，依次传递给O2，同时线粒体复合体将质子(H+)从线粒体内膜的基质侧泵到线粒体内外膜之间的膜间隙，使线粒体膜间隙产生大量的正电荷，线粒体基质侧则产生大量的负电荷，线粒体内膜两侧形成电位差(即线粒体膜电位，MMP)，当跨膜质子化学梯度足够高时，F0F1-ATPase利用质子顺电位梯度回流时所释放的势能催化ADP 和Pi 结合形成ATP[26]，因此，线粒体结构的完整性对MMP的维持和ATP的合成至关重要。Cucielo等[27]的研究结果显示，褪黑素疗法可通过诱导MMP水平下降阻碍细胞ATP合成，从而降低卵巢癌细胞生存优势；

Park等[28]研究发现，肝细胞cAMP含量的下降可抑制胰高血糖素信号，而细胞cAMP含量的下降主要由细胞ATP合成能力降低所致。本研究的结果表明，Fen暴露后TM3细胞ATP和cAMP含量均显著下降，MMP水平也显著降低，提示Fen可能诱导了TM3细胞线粒体损伤，导致细胞ATP和cAMP合成受阻。

线粒体损伤的发生机制尚不十分清晰。目前的研究表明，线粒体损伤与细胞ROS激增之间具有较强的相关性[29]。线粒体是ROS产生的主要部位，也是ROS最易攻击的部位[30]。Kong等[31]的研究显示，杀虫剂啶虫脒可引起雄性大鼠睾丸组织氧化应激，睾丸间质细胞因ROS激增而发生线粒体损伤，这可能与ROS引起线粒体内膜脂质过氧化反应导致其脂质双分子层断裂有关。此外，也有研究发现，Ca2+在细胞发生线粒体损伤的过程中同样发挥着重要作用[32-33]。Wang等[9]研究发现，ROS可诱发线粒体Ca2+超载，Ca2+通过上调c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平介导mPTP开放和线粒体损伤，在这一过程中，ROS的调节作用发生在Ca2+信号的上游。

为明确ROS和Ca2+在Fen所致TM3细胞线粒体损伤中的作用，本研究在TM3细胞暴露于Fen的同时，使用ROS清除剂NAC和胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM与TM3细胞共孵育。结果显示，Fen染毒后，TM3细胞ROS水平和胞浆Ca2+浓度均显著上升，NAC和BAPTA-AM均可缓解Fen暴露所致的TM3细胞线粒体损伤水平，表明ROS和Ca2+均参与介导了Fen暴露所致TM3细胞的线粒体损伤。此外，本研究结果表明，NAC和BAPTA-AM共孵育均可使Fen暴露后TM3细胞中ROS水平和胞浆Ca2+浓度同时降低，这提示在Fen所致TM3细胞线粒体损伤的发生过程中，ROS并不一定是Ca2+的上游信号，二者之间可能具有协同效应，即ROS可诱导细胞胞浆Ca2+浓度上升，反之，胞浆内Ca2+浓度上升也可诱导细胞ROS激增。这与Wang等[9]的研究结果不完全一致，提示ROS和Ca2+在调控不同细胞线粒体损伤中的作用机制可能存在一定差异。

线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放是线粒体损伤发生的重要表现之一。正常情况下，线粒体外膜具有较高通透性，而内膜的通透性相对较低，线粒体内膜的低通透性和电化学质子梯度是维持膜电位处于正常水平的基础。Kanno等[34]发现，ROS 诱导mPTP的开放将造成线粒体膜通透性转换(MPT)，这直接导致线粒体膜电位下降或丧失，并引起细胞ATP合成障碍。mPTP是一种存在于线粒体内外膜接触区的由多种蛋白复合组成的非特异性高导电性通道。目前mPTP的分子组成尚未完全明确，一般认为mPTP是由位于外膜的电压依赖性阴离子通道(VDAC)、位于内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)、位于线粒体基质的亲环素D(CyPD)以及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族蛋白等蛋白分子共同组成的[35]。Marzetti等[36]研究发现，老化的腓肠肌细胞凋亡率上升与mPTP开放水平增加有关，而mPTP开放有赖于其结构蛋白CyPD表达上调。为明确Fen所致TM3细胞线粒体损伤是否与mPTP开放有关，我们分析了Fen暴露后mPTP组成成分ANT4和CyPD的表达情况。结果表明，Fen暴露后ANT4和CyPD表达水平均显著上升，提示Fen暴露后TM3细胞mPTP开放水平升高；
NAC和BAPTA-AM均可抑制ANT4和CyPD的表达，表明ROS和Ca2+均可通过调控TM3细胞mPTP成分蛋白的表达调节mPTP的开放以及线粒体损伤。

综上所述，以上实验结果表明，Fen暴露后，TM3细胞ROS水平和胞内Ca2+浓度升高，二者通过协同作用使TM3细胞ANT4和CyPD表达水平上升，mPTP开放程度增加，引起TM3细胞MMP水平下降和线粒体损伤，细胞ATP和cAMP合成能力降低，cAMP/PKA信号通路依赖性的睾酮合成相关蛋白和酶表达下降，最终导致TM3细胞睾酮合成能力降低。然而本研究未能明确Fen暴露后TM3细胞ROS和Ca2+发生协同作用以及二者调控mPTP成分蛋白表达的具体机制，相关问题有待后续实验进一步明确。

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