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    坡柳种子精油对5种植物病原真菌的熏蒸活性及化学成分分析

    时间：2023-01-09 12:15:13来源：百花范文网本文已影响人

    刘全俊，付立新，2，张扬，李丰超，于航，李金梁，秦小萍*

    （1云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201；
    2德宏职业学院，云南芒市 678400；
    3云南农业大学水利学院，云南昆明 650201）

    【研究意义】立枯丝核菌（）、番茄灰霉病菌（）、尖孢镰刀菌（）、芒果炭疽病菌（）、番茄早疫病菌（）是引起水果和蔬菜病害的重要病原真菌（吴琼等，2018；
    郭敬等，2020；
    李其利等，2020；
    呼李乐等，2021；
    田春英等，2021），目前主要采用化学制剂防控上述病原菌引发的病害，但化学杀菌剂通常会对环境造成污染并引发病原菌的抗药性，因而越来越多的学者致力于开发无污染、低毒和低残留的合成杀菌剂替代品用于植物病原真菌控制。坡柳［（Linn.）Jacq.］又名车桑子，是无患子科（Sapindaceae）车桑子属（）常绿灌木，其化学成分丰富，具有抗菌、抗病毒、抗炎和杀虫等潜力（牛红梅，2010）。因此，从具有良好应用前景的坡柳中提取种子精油并探究其抗菌活性物质，对植物病害防控，保障农作物安全生产具有重要意义。【前人研究进展】赵红艳和杨美林（2006）采用菌落直径法研究坡柳种子提取物对4种病原真菌［燕麦镰刀菌（）、梨黑星病菌（VTanaka et Yamamoto）、烟草赤星病菌（）和番茄早疫病菌］菌落生长的影响，结果表明，乙醇提取物抑菌效果最好。赵红艳等（2007）研究发现氯仿提取物对米象［（Linnaeus）］有显著的触杀活性。秦小萍等（2008a，2008b）研究报道坡柳种子乙醇提取物对小菜蛾［（L.）］4龄幼虫具有很强的拒食作用，对高粱、小麦和稗草的幼根具有较好的抑制活性。Pirzada等（2010）用氯仿、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水提取坡柳叶片化学成分，并测试对黑曲霉（）、黄曲霉（）、拟青霉（）、石膏样小孢子菌（）和红色毛癣菌（）的抑制活性，结果发现氯仿提取物对供试真菌具有很强的抑制活性。吴道慧等（2014）及张余杰等（2014a，2014b）采用浸渍叶碟饲喂法测定坡柳皂苷对棉铃虫［（Hübner）］、大菜粉蝶（）、粘虫［（Walker）］生长发育的影响，结果显示，坡柳皂苷对棉铃虫、大菜粉蝶和粘虫的生长发育有抑制作用，且随浓度的增大而提高。代玉玲等（2015）采用无限量取食法、叶碟法和半叶法分别测定坡柳皂苷对果蝇（）的胃毒活性、小菜蛾幼虫的非选择性拒食活性及甘蓝蚜虫（）的选择性拒食活性，结果表明，坡柳皂苷对果蝇和小菜蛾具有较好的生物活性，对甘蓝蚜虫的活性一般。张扬等（2018）采用小孔树脂、凝胶Sephadex LH-20、反相色谱ODS及制备型高效液相色谱（PreHPLC）等分离技术从坡柳种子乙醇提取物中分离获得1种活性化合物，测试发现其对小菜蛾3龄幼虫具有较好的非选择性拒食活性。Bimani和Hossain（2020）以正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取坡柳叶片中化学成分，并测试对5种细菌的活性，结果表明，乙酸乙酯和氯仿提取物的抑菌活性最高，而正己烷提取物的抑菌活性最低。胡栋宝等（2021）以车桑子种子为试材，采用超声波辅助法提取总黄酮，并考察其体外抗氧化活性，结果表明，车桑子种子黄酮提取物对DPPH自由基和ABTS自由基具有较强的清除能力，且对Fe也具有较强的还原能力。于航等（2021）通过透射电镜观察了大菜粉蝶4龄幼虫取食含坡柳皂苷叶碟后的中肠组织病理变化，结果表明，在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼虫围食膜和微绒毛消失，肠细胞与底膜分离，腔内出现大量空泡，溶酶体活动剧增，细胞器及细胞体出现自溶，光面内质网极度膨大。【本研究切入点】近年来对坡柳种子的报道多见于其溶剂提取物应用方面，对其精油的研究较少。【拟解决的关键问题】以坡柳种子为材料，采用同时蒸馏萃取法获取坡柳种子精油，并用对扣熏蒸法测试其对5种植物病原真菌（立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌）的抑制活性；
    通过气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）进一步分析坡柳种子精油的化学成分，以期筛选出可有效防控植物病原微生物的天然产物，为下一步开发为植物源杀菌剂打下基础。

    1.1 试验材料

    坡柳种子购于云南生态技术有限公司，由云南农业大学植物学分类专家李孙文副教授鉴定，标本存放于云南农业大学植物保护学院化学楼生物农药实验室。供试菌株：立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌均由云南农业大学植物保护学院农药与化学生态实验室提供，用PDA培养基培养保存。

    主要仪器：SE602F型电子天平（上海洪纪仪器设备有限公司）；
    XL-60C粉碎机（广州旭朗机械设备有限公司）；
    DHT型搅拌调温电热套（鄄城光明仪器有限公司）；
    HH-2数显恒温水浴锅（常州市国华电器有限公司）；
    N-1100D型旋转蒸发仪（上海市泉杰仪器有限公司）；
    DLSB-5L/20型低温冷却液循环泵（巩义予华仪器有限公司）；
    SHZ-D（III）型循环水式真空泵（上海市子期实验设备有限公司）；
    水蒸气蒸馏装置，本实验室定制；
    安捷伦7890-5975N气相色谱—质谱联用仪（美国/安捷伦科技）。

    主要试剂：1-辛烯-3醇（1-octen-3-ol）［含量98%，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；
    亚油酸甲酯（Methyl linoleate）［含量98%，萨恩化学技术（上海）有限公司］；
    苯甲醛（Benzaldehyde）［含量99%，安耐吉（上海）有限公司］；
    -戊基丁内酯（-nonanolactone）（含量98%，萨恩化学技术有限公司）；
    2-正戊基呋喃（2-pentylfuran）［含量98%，阿拉丁试剂（北京）有限公司］；
    99%无水硫酸钠（天津光复科技发展有限公司）；
    二氯甲烷（AR）（天津富宇精细化工有限公司）。

    1.2 试验方法

    1.2.1 精油提取采用同时蒸馏萃取法，参照罗凯等（2012）的方法略作修改。称取70 g坡柳种子放入1 L的物料瓶中，加入700 mL蒸馏水混合均匀，在物料瓶中加入少量沸石；
    用量筒量取250 mL二氯甲烷（分析纯）加入另一500 mL平底烧瓶中；
    将物料瓶、烧瓶与水蒸气蒸馏装置固定连接，打开冷凝循环，打开电热套开关，调节温度，待第1滴馏出液滴下开始计时，蒸馏12 h后停止加热；
    待装置冷却后，取下蒸馏装置，向装有二氯甲烷的烧瓶中加入过量无水硫酸钠去水，振荡摇晃，过滤；
    浓缩滤液得坡柳种子精油，计算得率。将精油保存在棕色瓶中，封口备用。

    1.2.2 坡柳种子精油对5种植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用对扣熏蒸法（廖旺姣等，2014）测试精油对5种供试植物病原真菌的抑制活性；
    采用菌丝生长速率法测定精油对病原菌菌丝生长的抑制活性。无菌培养皿2个（内径9 cm），一皿为PDA培养基，在培养基中央接入1个病原菌菌饼（直径0.5 mm），另一皿为空白平板，分别设置10和50μL/L的一定体积的精油平均分布在滤纸片（直径2 cm）上，两皿合并（体积0.25 L）进行对扣熏蒸试验，PDA平板在下，涂药或空白平板在上。每种病原菌设1组对照，每处理3次重复。培养温度为（25±1）℃、光周期L∶D=24 h∶0 h。采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。

    1.2.3 坡柳种子精油成分分析GC条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；
    进样口温度230℃，检测器温度260℃；
    柱温：初始温度40℃，程序升温5℃/min升温至260℃，保持30 min；
    柱流量（Ne）为1.0 mL/min；
    柱前压100 kPa；
    进样量1.0μL；
    分流比10∶1；
    载气为高纯氦气。

    MS条件：电离方式EI；
    电离能量70 eV；
    离子源温度230℃，四级杆温度150℃，全扫描质量范围50～550 m/z记录质量谱；
    接口温度280℃；
    流速1.0 mL/min；
    采用NIST 05标准谱库计算机检索定性。

    1.2.4 坡柳种子精油的5种单体成分对5种植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用对扣熏蒸法：将1-辛烯-3-醇、亚油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁内酯和2-正戊基呋喃配置成50µL/L的溶液，测试对5种植物病原真菌的熏蒸抑制活性，测定方法同1.2.2。

    1.2.5 坡柳种子精油的2种单体成分对5种植物病原真菌熏蒸抑菌活性的抑制中浓度（IC）采用对扣熏蒸法：将1-辛烯-3-醇和苯甲醛配置成系列梯度浓度，分别测试对5种植物病原真菌的IC，测定方法同1.2.2。

    1.3 统计分析

    采用Excel 2010进行数据整理，用SPSS 20.0进行统计分析，Duncan’s新复极差法对不同处理的差异性进行分析，Probit概率分析法计算IC。

    2.1 坡柳种子精油得率

    以料液比1∶10提取12 h，消耗坡柳种子3000 g，得精油质量2.88 g，计算得出坡柳种子精油提取率为0.096%。

    2.2 坡柳种子精油对5种植物病原真菌的熏蒸抑菌活性

    如表1所示，坡柳种子精油对5种供试植物病原真菌有不同程度的抑制作用，随着精油浓度升高，对病原菌的抑制率也升高。当坡柳种子精油浓度为10μL/L时，对立枯丝核菌的活性最好，抑制率为60.50%，抑制率显著高于对其他病原菌处理（＜0.05，下同）；
    对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的活性最差。当坡柳种子精油浓度为50μL/L时，对尖孢镰刀菌的活性最好，抑制率为100.00%，抑制率显著高于对其他病原菌处理；
    其次是对芒果炭疽病菌的活性，抑制率为87.10%；
    对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的活性最差。

    2.3 GC-MS分析结果

    2.3.1 坡柳种子精油的总离子流图采用GC-MS分析坡柳种子精油，通过数据处理系统，按面积归一化法测得挥发油各组分含量。按照设定的GC-MS条件对坡柳种子精油进行分析，得坡柳种子精油总离子流图（图1）。

    2.3.2 坡柳种子精油的主要化学成分GC-MS分析结果显示，坡柳种子精油包含79种化合物（表2）。其中相对含量大于3.000%的有10种化合物，分别为苯甲醛（3.241%）、1-辛烯-3-醇（5.611%）、2-正戊基呋喃（5.896%）、-戊基丁内酯（5.820%）、亚油酸甲酯（5.507%）、1-己醇（5.328%）、2-丁基-2-辛烯醛（4.128%）、松柏烯（6.966%）、依兰油烯（3.464%）和棕榈酸甲酯（3.385%）。根据测试结果，参考市售的化合物种类，本研究选取1-辛烯-3醇、亚油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁内酯和2-正戊基呋喃等5种化合物进行抑菌活性测试。

    2.4 5种化合物对5种植物病原真菌熏蒸抑菌活性

    由表3可知，在处理浓度为50μL/L时，1-辛烯-3-醇和苯甲醛对5种植物病原真菌均表现出完全抑制；
    亚油酸甲酯对番茄灰霉病菌表现出活性，但对其余4种植物病原真菌无活性或活性差；
    -戊基丁内酯对立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀菌和番茄早疫病菌有不同程度的抑制活性，其中对尖孢镰刀菌的活性最好，抑制率为58.9%，其次是对立枯丝核菌，抑制率为50.7%，而对芒果炭疽病菌无活性；
    2-正戊基呋喃仅对立枯丝核菌具有活性，抑制率为51.9%，对其余4种病原菌无抑制活性。

    表1 坡柳种子精油对5种植物病原真菌菌丝的生长抑制率Table 1 Inhibition rate of essential oil of D.viscosa seed on mycelium of 5 plant pathogenic fungi

    图1 坡柳种子精油总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of essential oils of D.viscosa seed

    2.5 2种化合物对5种植物病原真菌熏蒸抑菌活性的IC50

    选择对5种供试植物病原真菌抑制活性最好的2种化合物苯甲醛和1-辛烯-3-醇进行熏蒸毒力测定，结果（表4）显示，2种化合物对5种植物病原真菌均有较好的抑菌活性。

    本研究采用同时蒸馏萃取法获取坡柳种子精油，使用对扣熏蒸法测试了坡柳种子精油对5种植物病原真菌的抑制活性，结果表明坡柳种子精油对供试5种病原真菌具有不同程度的抑制活性。利用植物精油抑制植物病原真菌的研究较多，有研究报道珊瑚姜块挥发精油（罗世琼等，2013）、薰衣草精油（刘凡等，2017）和百里香精油（张阿强等，2017）对立枯丝核菌具有较好的抑菌活性。Chala等（2014）用玫瑰草（）和黑小茴香（）的挥发物测试对芒果炭疽病菌的抑菌活性，结果显示对芒果炭疽病菌的生长抑制率为100%。本研究发现，坡柳种子精油在浓度为50μL/L时对立枯丝核菌和

    芒果炭疽病菌的抑制率分别为81.10%和87.10%，虽然测定方法不同，但比较测定浓度的差异性，坡柳种子精油对立枯丝核菌和芒果炭疽病菌的抑制效果明显，应给予高度关注。林霜霜等（2017）研究了柠檬香茅（）精油及其主要成分柠檬醛对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和辣椒尖孢镰刀菌的抑制活性，结果表明，在200 mg/L浓度下柠檬香茅精油对3种病菌的抑制率分别为67.02%、32.03%

    和20.42%。Zhao等（2021）研究发现，牛至（）精油对番茄灰霉病菌菌丝生长及孢子萌发有较好的抑制作用，当精油浓度为250 mg/L时对番茄灰霉病菌的抑制率可达96.39%，其成分中的香芹酚和百里香酚浓度为125 mg/L时对番茄灰霉病菌表现出完全抑制。本研究用50μL/L坡柳种子精油熏蒸尖孢镰刀菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌，抑菌率分别为100.00%、28.70%和28.60%。相比林霜霜等（2017）的结果，本研究使用的坡柳种子精油浓度更低，且对尖孢镰刀菌的抑菌效果较好，对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果较差；
    相比于Zhao等（2021）的结果，本研究所用浓度也偏低，若适当提高精油浓度，抑菌活性可能也会提升。

    表2 坡柳种子精油GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

    续表2坡柳种子精油GC-MS分析结果Continue Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

    表3 5种化合物纯品对5种植物病原真菌的熏蒸抑制率（%）Table 3 Fumigation inhibition rates of 5 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（%）

    表4 2种化合物纯品对5种植物病原真菌的IC50（μL/L）Table 4 IC50 of 2 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（μL/L）

    坡柳植物中化合物种类丰富，牛红梅（2010）从地上部分（枝、叶和果实）的甲醇提取物中共分离鉴定得到12种化合物，包括2种新的二萜类化合物和2种新的异戊烯基黄酮类化合物，其中的2种新型二萜类化合物对致倦库蚊（）4龄幼虫显示出毒杀活性。张来宾（2012）从其地上部分乙醇提取物的二氯甲烷部位共分离鉴定得到35种化合物，其中10种新的异戊烯基黄酮类化合物，7种新的二萜类化合物。本研究利用同时蒸馏萃取法获取坡柳种子精油，并用GC-MS分析了其化学成分，共得到79种化合物。相比牛红梅（2010）和张来宾（2012）的研究结果，坡柳种子精油化学成分种类更多。由于提取化合物的技术和溶剂不同，导致获得的化合物种类不同（徐凯节等，2013；
    牛彪等，2019），若要明确坡柳植物中化合物的种类，还有待深入研究。

    选取坡柳种子精油中的5种化合物苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、亚油酸甲酯和-戊基丁内酯纯品对5种植物病原真菌立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌进行活性测定，结果显示，苯甲醛和1-辛烯-3-醇在浓度为50μL/L时对5种供试植物病原真菌的抑制率为100.0%。1-辛烯-3-醇和苯甲醛作为食物香料和食物添加剂多通过化学途径合成（张雷亮等，2017）。Herrera等（2015）研究发现，1-辛烯-3-醇能有效防治玉米象甲（）和黄萎病真菌（）。Lee等（2001）研究发现，苯甲醛对稻象甲（）有较好的熏蒸毒力。李雪玲和凌玮玮（2010）研究了桃仁中苯甲醛的提取及其抑菌作用，结果表明，在0.5 mol/L硫酸、80℃条件下水解80 min提取的天然苯甲醛对霉菌和细菌均有一定的抑制作用。此外，苯甲醛衍生物在生物活性方面多有利用，李晓荣（2012）报道苯甲醛希夫碱对革兰氏阳性菌（G）的典型菌株金黄色葡萄球菌（）和革兰氏阴性菌（G）的典型菌株肺炎克雷伯杆菌（）具有抑菌作用。1-辛烯-3-醇和苯甲醛可作为食品香料及食品添加剂使用，且2种化合物对立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌具有较好的抑菌活性，结合其具有防腐性、芳香性的特点，表明1-辛烯-3-醇和苯甲醛在食品防腐研究及农业生产中植物病害防治上具有较好的应用前景。

    坡柳种子精油中化学成分种类丰富，其中1-辛烯-3醇和苯甲醛的活性最好。坡柳种子精油具有开发成为新型植物源杀菌剂的潜力。

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