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    不同IBV疫苗免疫鸡感染GVI-1型毒株后固有免疫相关基因的表达差异研究

    时间：2023-01-13 09:10:43来源：百花范文网本文已影响人

    李 敏，吕佳玳，刘月月，李俐睿，周潇潇，李桂黎，岳建国，黄 勇*

    （1.四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；
    2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

    本试验选用国内具有代表性的两个IBV疫苗株H120 和4∕91 和课题组 分离的GVI-1 分离株ZQX 作为研究对象，先选取在抵抗IBV 感染中发挥重要作用的固有免疫相关基因（TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6）为目的基因，设计引物，制作标准曲线，建立检测目的基因表达的荧光定量RT-PCR 方法，然后用两种常用的疫苗株H120和4∕91 分别免疫鸡，2 周后使用ZQX 攻毒，观察临床症状，统计发病率、死亡率，并采用荧光定量RT-PCR 方法测定不同疫苗免疫组在不同时间的固有免疫相关基因的表达倍数。从固有免疫角度对两个疫苗株的免疫机理进行分析，为明确IBV 的免疫机理和GVI-1 型毒株的致病机理提供参考。

    1.1 SPF鸡胚及IBV毒株 本试验所用SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，并在实验室自行孵化。4∕91疫苗购自Intervet公司，H120 疫苗购自中国兽药监察所，攻毒所用毒株ck∕CH∕YNSL∕160501（NCBI登录号：MN096598，以下简称ZQX）从四川省一家养殖场分离。采用Reed-Muench 法测定分离株ZQX 和疫苗株H120、4∕91 的鸡胚半数感染量（EID50）［1］，结果分别为105.28∕0.1 mL、106.80∕0.1 mL、106.32∕0.1 mL。

    1.2 主要试剂 总RNA 提取试剂盒（Trizol），PrimeScript RT-PCR Kit 反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ）、PMD19-T载体、限制性内切酶、Premix Taq，购自大连宝生物有限公司；
    PBS缓冲液；
    DNA Marker-L，购自生工生物工程（股份）有限公司。

    1.3 构建荧光定量PCR标准曲线

    1.3.1 引物设计 根据参考文献［2］的结果，直接选择ACTB 作为内参基因，内参基因ACTB 的引物参考已发表的文献，根据NCBI 上已发表的目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6 的核苷酸序列，利用Oligo7.0软件设计并优化引物，使扩增的目的片段保持在100～200 bp 之间，用于目的片段的扩增及标准曲线的建立。所有引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体信息见表1。

    表1 荧光定量引物信息

    1.3.2 标准曲线构建 参照文献［3］方法建立标准曲线。将标准质粒用ddH2O进行10倍倍比稀释，在LightCycler®96 SW 荧光定量PCR 仪上进行Real-time PCR反应，采用10 μL体系（上、下游引物各1.0 μL，0.8 μL 标准质粒和7.2 μL 双蒸水）。引物与模板两两组合，反应程序设定为：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，退火52～57 ℃30 s，延伸72 ℃20 s，40个循环。确定线性回归，并根据循环阈值（Ct 值）绘制含有插入物的质粒DNA 拷贝数的对数值，将Ct 值转换为拷贝数，构建内参基因及目的基因的标准曲线。

    1.4 试验方法

    1.4.1 免疫和攻毒方案 1 日龄SPF 鸡48 只，随机分为4组，每组12只，分别饲养在4个相互隔离的区域。在10 日龄时对鸡群免疫，24 日龄时对鸡群攻毒。具体方案为：A组、B组不免疫（用PBS缓冲液代替），10日龄时对C 组、D 组鸡分别进行H120和4∕91免疫，免疫剂量为105EID50∕0.1 mL，免疫方式为点眼和滴鼻；
    24日龄时分别对B、C、D组鸡接种ZQX 株，剂量为104EID50∕0.1 mL；
    A 组作为空白对照组接种PBS，剂量为0.1 mL∕只，接种方式为点眼和滴鼻。每组鸡自由采食，隔离饲养。攻毒后持续观察并记录各组鸡的临床症状、发病率、死亡率及组织剖检变化。

    1.4.2 固有免疫相关基因mRNA 表达差异的测定 分别在攻毒后1、3、5、7 d 每组随机剖杀3 只鸡，观察记录组织病变，无菌采集鸡的气管（不包括喉头）于液氮中保存备用。将气管剖开，用手术刀片刮取气管黏膜，提取RNA，反转录得到cDNA，于-70 ℃保存备用。以cDNA 为模板，采用已构建好的PCR 方法检测各个样品中内参基因ACTB及目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6的表达量，随后计算B、C、D组各个目的基因相对于对照组的表达倍数，使用2-△△Ct法计算表达比率，△△Ct＝（试验组目的基因的Ct值-试验组内参基因的Ct 值）-（对照组目的基因的Ct 值-对照组内参基因的Ct 值）。最后用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析。

    2.1 荧光定量PCR标准曲线的建立 本试验共建立了6个RT-qPCR标准曲线，将10倍倍比稀释的标准质粒在LightCycler®96 SW荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR 反应，反应结束后对样品进行编辑并分析，依次添加需要分析的选项，软件自动生成标准曲线。内参基因ACTB 的荧光定量标准曲线为Y＝-3.504LgX+2.93（X为起始模板的量，Y为Ct 值）；
    目的基因TLR3 的标准曲线为Y＝-3.314LgX+3.92；
    TLR7 的标准曲线为Y＝-3.289LgX+2.36；
    MDA5 的标准曲线为Y＝-3.508 1LgX+2.14；
    IFN-β的标准曲线为Y＝-3.115 7LgX+3.67；
    IL-6 的标准曲线为Y＝-3.497 51LgX+1.75。

    2.2 动物实验

    2.2.1 临床表现 攻毒后B、C、D 组鸡相继出现呼吸症状，表现为：打喷嚏、呼吸困难、气管啰音，且羽毛蓬松、精神沉郁、采食量下降，全程无鸡只死亡。A 组无临床症状，B 组攻毒对照组发病率为66.7%，C 组和D 组的发病率分别为25%、33.33%，说明疫苗株H120 和4∕91 对分离株ZQX均有一定的保护作用，能够明显降低鸡传支的发病率。

    2.2.2 剖检病变 剖检结果表明，ZQX引起的最普遍病变为气管出血、有黏液，其次为盲肠扁桃体出血、肾脏肿大及肠道出血，但是肾脏病变不是特别明显。疫苗株H120和4∕91对ZQX都具有一定的保护作用，两者差异不明显，统计结果见表2。

    表2 剖检病变统计

    2.3 固有炎症因子IFN-β mRNA表达水平的测定 IFN-β mRNA在攻毒后不同时间点气管黏膜中的表达情况如图1所示。A组为空白对照组，B组为攻毒组，C、D 组分别为H120、4∕91 免疫攻毒组。攻毒后免疫组C 组的IFN-β mRNA 表达水平在第1 d 和第5 d 出现了显著上调，D 组仅在第5 d 出现了上调；
    免疫组C、D 组的IL-6 mRNA 表达水平在第1 d显著上调，且C组上调水平高于D组，C、D 组在第3 d 也出现了上调，其余时间点及其他组的转录水平则都趋于稳定。

    图1 ZQX攻毒后气管中炎症因子IFN-β mRNA的表达情况

    2.4 固有免疫相关基因mRNA 表达水平的测定 TLR3、TLR7、MDA5的mRNA水平在攻毒后不同时间点气管黏膜中的表达情况如图2 所示。A组为空白对照组，B组为攻毒组，C、D组分别为H120、4∕91 免疫攻毒组。攻毒后，C、D 免疫组TLR3 的mRNA 表达水平在第3 d 显著上调，且C组的上调水平显著高于D组，其他时间点都趋于稳定；
    B 组攻毒组TLR7 mRNA 的表达水平在第5 d出现了显著上调，免疫组中只有C组在攻毒后第3 d 出现了显著上调，其余时间点及其他组的转录水平则都趋于稳定甚至显著下调；
    对于MDA5 mRNA的表达水平，C组在第1 d就出现了显著上调，D 组到第3 d 才出现了这种显著性上调，而后在第5、7 d 免疫组与感染组都呈现出不同程度的显著下调，TLR7也出现了相同的状况。

    图2 ZQX攻毒后气管中TLR3、TLR7、MDA5 mRNA的表达情况

    疫苗免疫是防控鸡传支（IB）的主要策略，但IBV 毒株的变异常降低疫苗的有效性和保护性［4］。IBV 疫苗的免疫和保护机制非常复杂［5］。GVI-1型分离株ZQX 是近几年流行的IBV 新毒株［6］，致病性不强，动物实验的解剖病变与H120 免疫攻毒组和4∕91免疫攻毒组相比差异不明显，因此进一步通过实时荧光定量PCR对其5个目的基因的表达水平进行检测。

    比较不同组间炎症因子mRNA 的表达水平，可以发现免疫组的表达量在前期均高于空白对照组和攻毒组，但是对比攻毒组其上调趋势随着时间的推移逐渐减缓，逐步与机体本身炎症因子的表达水平持平，这可能是因为免疫组前期通过上调抗病毒天然免疫通路对病毒进行清除，导致了下游干扰素与白介素因子的一部分上调。

    综合比较H120免疫攻毒组和4∕91免疫攻毒组各个目的基因表达高峰出现的时间，发现H120免疫攻毒组中基因的表达高峰几乎都在4∕91 免疫攻毒组之前，也就是说H120 疫苗株发挥作用的时间早于4∕91疫苗株。由于H120免疫株是由IBV Mass 型的H株传120获得的，故其对机体的适应性更高，在相同情况下的复制能力比4∕91更强，对机体的保护作用也更迅速。

    H120 和4∕91 疫苗对ZQX 株能提供一定程度的临床保护。H120 疫苗攻毒组，在攻毒后1 d MDA5 mRNA 的表达水平达到高峰，攻毒后3 d TLR3、TLR7 mRNA的表达水平达到高峰；
    4∕91疫苗攻毒组，在攻毒后7 d TLR3、TLR7 mRNA的表达水平达到高峰，在攻毒后3 d MDA5 mRNA 的表达水平较高。H120 疫苗攻毒组，在攻毒后1 d IFN-β mRNA、IL-6 mRNA 的表达水平达到高峰；
    4∕91疫苗攻毒组，IFN-β mRNA的表达水平在攻毒后5 d 达到高峰，IL-6 mRNA 的表达水平在攻毒后1 d 达到高峰。可见H120 免疫组感染ZQX 后固有免疫相关基因的表达比4∕91 免疫组更为快速。

    本研究探讨了H120免疫攻毒组和4∕91免疫攻毒组中5 个固有免疫相关基因在攻毒后1、3、5、7 d 的表达差异，得到了各个基因的表达动态，有利于在免疫学水平上阐明机体抵抗病毒感染的原因，为以后IBV 的天然免疫研究提供一定的参考。

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