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    基于网络药理学和分子对接技术探讨驱痛散治疗急性腰扭伤的作用机制

    时间：2023-01-16 16:50:28来源：百花范文网本文已影响人

    王 君

    (河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

    急性腰扭伤(acute lumer sprain,ALS)是指腰肌、筋膜、韧带等软组织因外力作用突然受到过度牵拉而引起的急性撕裂伤,主要由过度负荷、姿势不当或运动前准备不足而致腰痛和腰部活动受限。据统计，60%～80%成年人，特别是青年、中年人和体力劳动者会发生急性腰扭伤，严重影响人们日常生活[1]。目前，西医有两种治疗方法。一种是抗炎解热药，通过阻断细胞周期、抑制前列腺素的合成来缓解疼痛；
    一种为封闭治疗，作用时间较短[1]。故目前诸多研究旨在寻求替代疗法。既往研究证实，中医药治疗ALS具有良好效果[2]。虽然驱痛散对ALS有较好效果，但由于其多成分、多靶点的特征，传统的研究分析方法很难系统地阐明其整体作用特点，网络药理学的出现为研究中药复方提供了新的方向[3]。笔者基于网络药理学方法挖掘现有数据库对驱痛散的有效成分进行筛选，采用分子对接法验证筛选出的核心活性成分和核心蛋白相互作用强度，对驱痛散作用于ALS的机制进行探讨，为进一步研究驱痛散治疗ALS提供科学依据。

    本研究借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索出泽兰、木瓜、薄荷、侧柏叶、延胡索、大黄、黄柏、青黛、三七、小茴香的活性成分和作用靶点信息。使用人类基因数据库(GeneCards)筛选ALS的靶点数据集，上传至在线韦恩图获取上述药物的活性化合物和其相关疾病的韦恩图和交集基因。

    通过 Cytoscape 3.7.2 软件构建“活性化合物-靶点基因”相互作用关系的网络图。基于网络中节点拓扑结构特征值筛选主要活性成分及主要作用的靶点基因。

    在String数据库(https://string-db.org/Version 10.5)内输入“药物-疾病”相同靶点基因，设置相应蛋白关系评分从而得到PPI网络。

    利用 Cytoscape 3. 7. 1 软件里的CluoGO插件，选择P< 0.01的通路和生物过程，进行药物活性成分发挥作用的生物过程和调控通路富集分析。

    采用分子对接法验证所筛选出的核心活性成分和核心蛋白相互作用强度。活性成分结构、蛋白质结构所得分别通过有机小分子生物活性数据库(PubChem)、蛋白质结构数据库 (PDB)。分子对接软件为 AutoDock Vina ，并用 Pymol 软件进行优化。

    6.1 中药复方的活性成分及相应靶蛋白

    依据TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，设置口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18进行筛选。得到中药复方药物活性成分145种，其中泽兰2种，木瓜4种，薄荷10种，侧柏叶7种，延胡索49种，大黄16种，黄柏37种，青黛9种，三七8种，小茴香3种。

    6.2 活性成分及靶点的获取

    分别将药物活性化合物及对应靶点，疾病的相关基因靶点上传至在线韦恩图，获得230个共性靶点。见图1。

    图1 共同靶点韦恩图

    6.3 中药复方调控网络的构建及 CytoNAC 网络拓扑分析

    将获取的ALS相关靶点和驱痛散靶点进行匹配，获得驱痛散治疗ALS的潜在基因231个。

    采用Cytoscape软件进行驱痛散调控ALS网络构建。见图2。

    图2 成分-靶点网络图

    6.4 蛋白质相互作用网络构建

    使用 String 数据库获取中药复方治疗 ALS 相关靶标的相互作用关系，导入 String 数据库，构建PPI 网络图并进行分析。结果发现,共有230个节点，4 141条线，平均节点度值为36。见图3。进一步借助 Cytoscape 3.7.2 软件对PPI网络数据进行拓扑分析，最终得出RELA、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)8成分与靶点的关联数量较多，可能是驱痛散治疗ALS的潜在诊疗靶点。见图4。

    图3 PPI 互作网络图

    图4 核心靶蛋白基因筛选路径(集群1～6)

    6.5 GO 生物学功能分析

    将230个潜在靶点映射到 DAVID 数据库中进行生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)分析，共得到BP 682个，CC 73个 ，MF 139个。筛选BP、CC、MF中P值最小的前 20个生物学功能并绘制其条形图。生物过程主要包括：药物反应(response to drug)、乙醇应答(response to ethanol)、RNA聚合酶转录正反馈(transcription from RNA polymerase II)、启动子(promoter)、脂多糖应答(response to lipopolysaccharide)、衰老(aging)等。细胞组成主要包括：细胞外隙(extracellular space)、细胞质(cytosol)、轴突末端(axon terminus)、膜筏(membrane raft)、膜小凹(caveola)等。分子功能主要包括：酶结合(enzyme binding)、蛋白结合(protein binding)、蛋白酶同源二聚体(protein homodimerization activity)、同蛋白结合(identical protein binding)、蛋白质同源二聚体(protein heterodimerization activity)等。见图5～7。

    图5 驱痛散主要作用靶点 BP 条形图

    图6 驱痛散主要作用靶点 CC 条形图

    图7 驱痛散主要作用靶点 MF 条形图

    6.6 KEGG 通路分析

    运用R语言对所有靶点进行 KEGG 通路富集分析，共筛选出131条相关通路，对P值最小的 20 条通路绘制相关条形图，见图8 。KEGG富集分析所涉及的通路包括乙型肝炎(Hsa05161:hepatitis B)、癌症(Hsa05200:pathways in cancer)、膀胱癌(Hsa05219:bladder cancer)、TNF(Hsa04668: TNF signaling pathway)、PI3K-AKT(Hsao04151:PI3K-AKT signaling pathway)、Toll(Hsa04620:Toll-like receptor signaling pathway)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)(Hsa04066:HIF-1 signaling pathway)、FOXO(Hsa04068:FOXO signaling pathway)等。

    图8 驱痛散主要作用靶点 KEGG 富集气泡图

    6.7 较优活性成分与核心靶点对接结果

    对图 4 药物-活性成分-靶点-疾病网络图进行拓扑网络数据分析，得出核心活性成分为β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素，核心靶点为RELA、CXCL8、MAPK8、白细胞介素(IL)-6等。对排前3名的受体蛋白RELA、CXCL8、MAPK8(图4集群6显示)进行分子对接。在AutoDock Vina 1.1.2软件中将各个配体小分子与受体蛋白逐个对接，结合能及对接参数如表1所示。结合能越小说明结合活性越强烈，当≤-5.0 kcal/mol 时显示分子对接有潜在研究意义，结合能≤-7.0 kcal/mol 说明受体与小分子之间对接效果极佳[4]。核心成分与β-谷甾醇、豆甾醇槲皮素的结合能数值显示本次对接有研究意义,见表1。将RELA、CXCL8、MAPK8与β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素对接在Pymol软件中构图，见图9。

    表1 活性成分与核心靶点对接值

    图9 活性成分与核心靶点对接图

    《诸病源候论》曰：“劳损于肾，动伤经络……风冷、血气互搏，发为腰痛。”故中医药治疗ALS原则为祛瘀活血、通络止痛。驱痛散为临床经验方。方中泽兰、延胡索活血散瘀，理气止痛；
    三七止血散瘀、消肿止痛；
    木瓜、薄荷舒筋活络，行气通络；
    小茴香性温，味辛而甘，行气止痛；
    侧柏叶止血；
    青黛、黄柏、大黄清热解毒止痛。诸药合用，共奏祛瘀通络、活血止痛之功。

    驱痛散中主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等。甾醇被称为“生命的钥匙”，其中β-谷甾醇和豆甾醇最为常见，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[4-5]。研究[6]发现，β-谷甾醇通过抑制核转录因子(NF-κB)的磷酸化从而抑制实验性结肠炎小鼠肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的炎症表达，并呈浓度依赖性。另有研究[7]发现，β-谷甾醇通过抑制NF-κB、激活核因子E2相关因子(Nrf-2)/血红素加氧酶-1(HO-1)通路发挥其抗炎的作用。有学者[8]在探讨豆甾醇对脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠脑组织炎症因子、抗氧化能力和凋亡信号通路的影响时发现，豆甾醇组一氧化碳和丙二醛水平显著低于I/R组，环氧化酶-2 (COX-2)和NF-κB p65表达也显著低于I/R组；
    Nrf2和HO-1表达显著增加，抗氧化酶和超氧化物歧化酶活性升高；
    豆甾醇能下调细胞凋亡因子(Bax)和裂解半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的表达。研究[9]证实，豆甾醇通过抑制IL-1β调控NF-κB 通路，进而抑制炎症介质和基质降解，减缓关节炎症引起的软骨退化。槲皮素作为一种可治疗与关节炎相关的疼痛和炎症的天然化合物，具有免疫调节、抗氧化、抑制MAPKs生成、抑制炎症介质的表达和分泌，以及抑制滑膜细胞增生等多种生物活性[10]。有研究采用槲皮素治疗Ⅱ型胶原免疫性关节炎小鼠，结果血浆中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9及C反应蛋白均显著降低，足部TNF-α、CCL2、MMP-3 和 MMP-9 表达也明显降低[11]。槲皮素对炎症过程的调节作用涉及多种信号途径，包括PI3K、MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)等[12]；
    其还可能通过改变PI3K与ATP结合，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，使激活的AMPK抑制PI3K的活性，从而触发抗肿瘤和抗炎反应[13-14]。

    CXCL8是由不同类型细胞分泌的一种促炎趋化因子，其表达受多种细胞因子(IL-1、IL-6、CXCL12、TNF-α)、缺氧、活性氧(ROS)、细菌颗粒等的刺激，并由转录因子NF-κB和激活蛋白-1 (AP-1)介导[15-16]。研究发现，CXCL8-CXCR1/2轴保护宿主免受进一步感染和组织损伤的机制是CXCL8-CXCR1/2在感染部位吸收中性粒细胞，诱导中性粒细胞氧化爆发，释放颗粒，消除炎症刺激，提高细菌清除率[17-18]。MMPs以无活性酶原的形式存在于正常的椎间盘组织内，MMPs参与关节软骨细胞外基质分解，同时作用于其他细胞因子，一定程度加快炎性细胞因子的分泌[19]。有学者[20]在豆甾醇对兔关节炎模型软骨降解作用机制的研究中发现，与正常组相比，软骨关节炎组MMPs较高，基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)明显降低，豆甾醇通过抑制 MMPs 表达减缓软骨降解。RELA作为典型炎症信号通路NF-κB中一员，通过调控NF-κB的转录活性，发挥其抗炎作用[21]。

    GO富集分析结果显示，富集的生物过程主要包括细胞凋亡、细胞膜转运、氧化应激和细胞对非生物刺激的反应等。KEGG富集分析所涉及的通路包括TNF、PI3K-AKT、Toll、HIF-1、小细胞肺癌、乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌等信号通路。PI3K-AKT作为细胞内信号转导经典通路，广泛存在于类风湿关节炎(RA)滑膜组织中，在其被异常激活时可通过调控细胞生长、增殖、分化、凋亡来影响疾病的发病进程[22-23]；
    此外，该信号通路对脂多糖诱导的急性炎症反应具有负调节作用[24]。有学者[25]将重组腺病毒(Adspry2)作用于成纤维样滑膜细胞(FLS)，发现Adspry2作用的 FLS 的炎症因子表达水平较编码绿色荧光蛋白(ADGFP)的腺病毒载体组和未作用ADGFP组明显降低，Sprouty(SPRY2)可以通过调节PI3K/AKT及ERK信号通路有效地降低RA-FLS细胞中炎症介质的产生，同时抑制FLS的过度增殖，发挥治疗RA的作用。本研究通过网络药理学推测，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇可能通过抑制CXCL8、MPKA8、RELA及调控PI3K、Toll、HIF-1、TNF通路，调整下游蛋白，降低细胞凋亡，从而触发抗炎反应，发挥治疗作用。此为临床推广应用驱痛散提供了依据。

    综上所述，驱痛散可能通过其主要成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等作用于关键靶点CXCL8、MPKA8、RELA，发挥对PI3K-AKT、TNF、Toll、FoxO信号通路的调控作用从而干预细胞凋亡和增殖、抑制炎症反应来治疗急性腰扭伤。此以中医整体观念为指导思想，基于复方治疗疾病多成分-多靶点-多途径的特点，为临床诊疗ALS提供新的思路。本研究在数据库完整性、筛选策略、炮制对药性改变等方面仍存在很多不足之处，因此还需临床及体内外实验进一步验证。

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