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    新型可降解光固化生物医用黏合剂的制备及其性能研究

    时间：2023-01-29 12:00:20来源：百花范文网本文已影响人

    杨春芳，高 瑞，黄平升，冯祖建，王伟伟

    世界上每年都有数以百万人遭受创伤的困扰，需要进行适当的伤口闭合。

    传统的伤口闭合方式如缝合、打钉和医用胶带固定等，虽然可以比较稳固地将伤口对接起来，但难以避免术后拆换线、术后留瘢、较高的操作难度且止血不够及时等缺点。随着医学科技的进步和医疗理念的更新， 需要寻求更加方便快速、功能全面的伤口闭合方式[1，2]。生物黏合剂作为生物医学领域的“胶水”，具有使用方便、作用快速、不带来手术创伤的特点，且能在伤口部位提供愈合环境，有希望成为手术缝线的替代物[1，3，4]。

    在过去数十年间，多种类型的组织黏合剂、密封剂及止血剂被研发并运用于密封组织，防止出血或漏气， 然而现存的生物黏合剂仍然缺乏足够的黏合强度，无法完全替代缝线或吻合器，只能作为辅助封闭手段[5]。

    高强度黏合剂，例如氰基丙烯酸酯等，通常又会带来无法忽视的细胞毒性和组织刺激性[6]。

    因此如何构建兼具高黏合强度和高生物相容性的黏合剂是一个具有挑战性的课题。

    与组织特性、周围环境和病理状态相匹配的黏合剂， 将提供更好的治疗效果，开启精准医疗的新篇章[2，7，8]。

    在实验研究中，笔者以木糖醇、衣康酸和癸二酸为原料，通过缩聚反应制备了聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）[poly（xylitol-itaconic acid-sebacate），PXIS]生物医用黏合剂（简称PXIS）。

    其中衣康酸是含有不饱和双键的活泼二元有机酸，可以在光引发下发生自由基聚合，实现进一步的交联固化，提高黏合剂的强度[9，10]。

    利用流变学实验探究了不同原料配比对PXIS黏性及其固化时间的影响。利用力学性能实验考察了PXIS 在压缩和拉伸条件下的机械性能表现， 而后使用搭接剪切实验考察了PXIS 对玻璃基材的黏附强度。最后，通过体外细胞毒性实验及体内埋植实验，探究了PXIS 的生物相容特性。

    体内外实验结果表明，PXIS 是一种可快速光固化、 黏附性能良好和强度可调节，以及安全无毒的医用黏合剂，有望运用于组织损伤的封闭与愈合。

    1.1 实验材料与仪器

    1.1.1 实验材料与主要试剂

    木糖醇、衣康酸、1，10-癸二酸、2-羟基-4"-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮， 由中国天津希恩思生化科技有限公司提供。

    2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，由中国北京百灵威科技有限公司提供。

    C57 小鼠15 只，鼠龄6 周，体质量（20±2）g，雌性。

    由北京维通利华动物实验中心提供，饲养于独立通风笼具设备中。

    实验动物许可证：SYXK（津）2019-0002。

    BALB/c 小鼠15 只，鼠龄6 周，体质量（20±2）g，雌性。

    由北京维通利华动物实验中心提供，饲养于独立通风笼具设备中。实验动物许可证：SYXK（津）2019-0002。

    小鼠成纤维细胞3T3，由上海佰晔生物科技中心提供。

    1.1.2 主要仪器

    DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（北京英仪科贸有限公司， 中国）；
    2XZ-4 型旋片式真空泵（YC7144。

    浙江台州求精真空泵有限公司，中国）；
    傅里叶红外光谱仪 （NICOLET Is10。

    Thermo Fisher，美国）；
    核磁共振波谱仪（AVANCE III，400 MHz。

    布鲁克，德国）；
    多功能流变仪（MCR 302。

    Anton Paar，澳大利亚）；
    万能拉力试验机（Instron，美国）；
    正置荧光显微镜 （BX53F。

    OLYMPUS， 日本）；

    酶标仪（Thermo Fisher，美国）。

    1.2 方法

    1.2.1 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的制备

    将0.1 mol 木糖醇、0.02 mol 衣康酸和0.08 mol癸二酸加入100 mL 圆底烧瓶，置于140 ℃油浴锅中，在氦气流通下、磁力搅拌（100 r/min）约30 min，至完全熔融。

    在135 ℃真空反应6 h 后，加入1.5 mg 2-羟基-4"-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮 （光敏剂）和10 mg 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（阻聚剂），混合均匀后，将产物PXIS 倒入10 mL 注射器中，排尽空气，密封保存以待用。

    上述为PXIS-2 的合成方法，其余PXIS 的合成参照表1 所示的摩尔比，方法同上。

    表1 PXIS 的原料、配比及反应条件Tab. 1 Raw materials, proportions and reaction conditions of PXIS

    1.2.2 黏合剂聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的表征

    （1）PXIS 的核磁表征：
    采用1H-核磁共振波谱（nucler magnetic resonance spectroscopy，NMR）法在室温条件下测定PXIS 的化学结构，氘代试剂为CDCl3，基于谱图中相关特征峰的位置和积分面积以确定合成产物的结构。

    （2）PXIS 的红外表征：
    将少量PXIS 与干燥的KBr 固体粉末共同研磨并混合均匀，将混合粉末压片后，使用傅里叶红外光谱仪进行测试。

    （3）PXIS 的流变学测试：在37 ℃条件下，将PXIS样品均匀平整地涂抹在多功能流变仪测试平台上，使用直径10 mm 的转子， 在刮去多余样品后， 以转速10 rad/s 进行黏度测试。

    （4）PXIS 的固化性能测试：
    将PXIS 平铺至聚四氟乙烯模具中，使用紫外点光源（365 nm）照射至完全固化（不再具有黏流体性质），统计所需的固化时间。

    1.2.3 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的力学性能测试

    用于压缩实验的PXIS 样品条的制备：将PXIS均匀填充到聚四氟乙烯模具中，紫外线（365 nm）照射固化2 min，得到直径10 mm、高10 mm 的固体柱状样品。

    用于拉伸实验的PXIS 样品条的制备：
    将PXIS均匀铺展到聚四氟乙烯模具中，于紫外线（365 nm）照射固化2 min，得到长50 mm、宽10 mm、高1 mm 的固体片状样品。

    拉伸实验：
    使用万能拉力机对PXIS 进行拉伸测试。参数如下：拉伸速度10 mm/min；
    实验结束指标：样品条彻底断开。对各样品的杨氏模量进行统计学分析。

    压缩实验：使用万能拉力机对PXIS 进行压缩测试，压缩速度为5 mm/min，得到应变-压缩模量曲线。

    1.2.4 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的黏附性实验

    搭接剪切样品制作：如图1 所示，将PXIS 均匀地涂抹在玻璃基材（50 mm × 10 mm × 1 mm）的一端表面（涂胶面积为10 mm×10 mm），将另一块同规格的玻璃基材的一端覆盖于胶面之上，用紫外线（365 nm）进行照射固化2 min 即可。

    图1 搭接剪切实验示意图Fig.1 Schematic diagram of lap shear test

    搭接剪切实验：万能拉力试验机的参数，拉伸速度10 mm/min；
    实验结束指标为两块玻璃基材完全分离。对各样品的剪切强度和界面韧性进行统计学分析。

    适合于临床应用的黏合剂， 应当具有快速固化、足够的剪切强度与适宜的组织顺应性等特性。

    1.2.5 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的生物相容性实验

    （1）细胞毒性实验。

    材料浸提液的制备：将0.1 g PXIS-2 样品（10 mm ×10 mm × 1 mm）浸泡于50 mL的达尔伯克改良伊格尔培养液 （Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中，48 h 后，用0.2 μm 滤膜将浸提液滤过，紫外线照射12 h 后备用。

    细胞培养：将小鼠成纤维细胞3T3 复苏，并置于DMEM 中培养；
    传至第3 代时，待细胞密度至约50%，将细胞制成密度为104/mL 的细胞悬液， 按照每孔100 μL 加至96 孔细胞培养板中，培养12 h（37 ℃、体积分数5%CO2）。

    细胞毒性实验：将上述PXIS 浸提液用DMEM 稀释至特定倍数后，以换液的形式加入到96 孔板中。培养1 d 后， 配置含有10%CCK-8 溶液 （2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐） 的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）， 以换液的形式加入到96 孔板中（每孔100 μL），培养40 min 后，使用酶标仪检测各孔于450 nm 处的光密度。

    （2） 红细胞溶血实验：
    使用肝素管从6 周大的C57 小鼠的眼眶中收集血液。

    将3 mL 新鲜血液加入2 mL 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）中制成悬浮液。

    将悬浮液分装到5 个1.5 mL EP 管中，离心5 min（37 ℃、1 000 r/min）。

    去掉上清液，用1 mL 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）重悬红细胞。然后，将红细胞加入0.9%氯化钠溶液（生理盐水）200 μL（阴性对照组）、PXIS 0.9 %氯化钠溶液（生理盐水）提取物200 μL（实验组）、Triton 0.5 wt%（阳性对照组），于37 ℃条件下静置1 h，观察后取上清液，用酶标仪测量398 nm 处光密度。

    （3）皮下埋植实验：实验前将PXIS-3 在60 ℃热熔后置入模具中，用紫外线固化2 min，制成10 mm×10 mm×2 mm 的矩形样品， 浸泡在PBS 中。

    植入过程：
    将一块制备好的PXIS 样品植入BALB/c 小鼠下背部两侧皮下，缝合开口。

    植入后第56 天处死小鼠，取植入部位皮肤及心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏，切片采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，进行病理学检查。

    1.3 统计学方法

    所有数据均使用GraphPad Prism 软件进行非配对t 检验统计分析，分析结果均以平均值± 标准差表示。

    P<0.05 为差异有统计学意义。

    2.1 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的表征

    在PXIS 的1H-NMR（图2A ）中，3.5 × 10-6处醇羟基峰、1.6 × 10-6处癸二酸亚甲基峰、6.0 × 10-6处衣康酸双键氢峰的出现，以及红外光谱图（图2B ）中2 930/cm 处亚甲基、1 710/cm 处羰基及3 410/cm 处羟基伸缩振动峰的出现、产物羟基丰度较木糖醇的下降，证明了PXIS 合成成功。

    图2 PXIS 的1H-NMR（A）及红外光谱图（B）Fig.2 Diagrams of 1H-NMR(A)and infrared spectra(B)of PXIS

    2.2 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的流变学性能及固化时间

    PXIS 在37 ℃条件下，黏度都小于1 100 Pa·s，说明PXIS 黏合剂的挤出及施布的可行性。

    癸二酸作为柔性长链二酸，链段规整紧密，所以随着癸二酸比例的升高，PXIS 黏度逐渐升高。而随着木糖醇含量的逐渐降低，聚合物嵌段物理交联点变少，PXIS 黏度逐渐下降。PXIS 的固化时间与衣康酸含量负相关，因为紫外线照射固化的本质是衣康酸中不饱和双键在光引发下发生的自由基聚合反应。

    综上结果，PXIS-2 和PXIS-3 具有适中的黏度及固化时间。

    见表2。

    表2 PXIS 的黏度及固化时间Tab.2 Viscosity and curing time of PXIS

    2.3 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的力学性能

    PXIS 在压缩下没有显示出明显的屈服或断裂，压缩模量介于295 ～438 kPa，说明PXIS 样品具有良好的抗压缩性（图3A）。

    拉伸实验结果（图3B）显示，PXIS 面对机械拉伸表现出了良好的弹性， 其中PXIS-3 的弹性模量为（220.88 ± 30.46） kPa，显著高于其余PXIS（P=0.001 3），这是因为PXIS-3 中衣康酸含量高，经相同时间的照射固化后，具有更高的交联密度。

    图3 PXIS 的压缩（A）及拉伸（B）实验Fig.3 Diagrams of compression(A)and tensile(B)test of PXIS

    2.4 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的黏附性质

    PXIS 对于玻璃、木头、塑料、金属和硅胶等多种代表性基材都显示出了强力的黏附能力 （图4）。

    应力-应变曲线显示，PXIS 样品在应变为20% 左右时发生脆性剥离，其中PXIS-3 的剥离强度最高，数值为（8.59±0.13）MPa（图5）。

    黏合剂的内部自聚力和黏合剂与基材之间的界面力是决定黏合剂总黏合强度的两个关键因素，而搭接剪切样品的剪切强度和其界面韧性可以分别反映这两个因素。

    实验选取的PXIS 样品的剪切强度差异和界面韧性差异无统计学意义（P = 0.636 0、0.453 5），剪切强度和界面韧性分别在5 ～10 MPa 和9 500 ～16 000 J/m2内（图6）。

    图4 PXIS 对不同基材的黏附情况Fig. 4 Diagrams of adhesion properties of PXIS in different substrates

    图5 4 种PXIS 对玻璃搭接剪切样品的代表性应力-应变曲线Fig.5 Representative stress-strain curves of 4 PXIS for glass lap shear samples

    图6 4 种PXIS 对玻璃搭接剪切样品的剪切强度与界面韧性对比柱状图Fig.6 Comparison of shear strength and interfacial toughness of 4 PXIS for glass lap shear samples by histogram

    2.5 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的生物相容性实验

    采用小鼠成纤维细胞3T3， 检测PXIS 的细胞毒性。如图7 显示，培养24 h 后，与DMEM 组（85.37%～99.60%）相比，PXIS 组细胞存活率（88.16%～102.42%）差异无统计学意义（P=0.445 9）。

    且随着稀释倍数的提高，细胞存活率也没有明显的变化。

    因此，PXIS 对3T3 细胞没有毒性。

    图7 PXIS 浸提液不同稀释比例、 不同时间对3T3 细胞存活率影响柱状图Fig.7 Effect of different dilution ratio and time of PXIS extract on 3T3 cell survival rate by histogram

    溶血实验实验组溶血率为（1.56±0.14）%，阳性对照组溶血反应率为（99.99±7.76） %，阴性对照组为 （0.01±0.04）%。

    实验组溶血率与阴性对照组相当，显著低于阳性对照组（P ＜0.000 03、0.000 02）。

    体内埋植实验（图8）表明，8 周后BALB/c 小鼠的埋植区域皮肤中炎性细胞已不再聚集，炎症基本消退。埋植小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等脏器与未埋植的对照组相比，无明显炎性细胞浸润或病理结构的改变。

    以上结果证明了PXIS 具有优良的生物相容性。

    图8 BALB/c 小鼠皮下埋植PXIS 的皮肤、内脏的HE 染色切片病理图Fig.8 Pathology images of subcutaneously implanted PXIS in BALB/c mice by HE staining

    比起缝合等传统的伤口闭合方式，医用黏合剂具有使用方便、止血快速、不带来手术创伤且无需拆换线等优点，有希望成为手术缝线的替代物。

    但目前已经上市的医用黏合剂因受限于有限的黏接强度及机械强度，往往都只用于辅助传统伤口闭合方式，起到进一步固定、防止气液渗漏等作用。

    如何能得到可以单独封闭伤口的医用黏合剂， 是一个值得思考的问题。

    为了获得高黏附度、良好机械性能的生物医用黏合剂，笔者设计合成了新型生物医用黏合剂PXIS。所制备的PXIS 具有强力的黏附力、优良的机械性能和良好的生物相容性，有希望用于医疗手术中单独封闭伤口。

    利用木糖醇、衣康酸和癸二酸等低成本的生物相容性原材料，一步合成了多种原料配比的PXIS。PXIS可于常温下储存，几乎所有比例的PXIS 在37 ℃下的黏度都在1 100 Pa·s 以下，故可轻松挤出涂布。

    在紫外光照射下PXIS 会迅速进行交联固化，固化时间介于13 ～186 s（除PXIS-1 的固化需要近5 min 外）。

    说明在较短的操作时间内，PXIS 黏合剂就可以固化为胶贴片。

    力学性能表现是衡量一种黏合剂是否可以将伤口区域牢固固定、是否可以对抗拉伸及压缩等动态环境变化的重要指标。

    PXIS 对于压缩及拉伸都表现出了良好的抗性。此外，PXIS 对常见的基材都表现出了强力的黏接能力，对于玻璃搭接剪切的最大强度达到了近10 MPa，最大界面韧性达约16 000 J/m2，充分证明了PXIS 优异的黏附性能。

    生物相容性是生物医用黏合剂应当具备的基本属性，理想的生物医用黏合剂应具有良好的生物相容性，不引起组织过度的排异反应。

    图5 ～7 系列相容性实验结果表示，PXIS 不会影响正常细胞的增殖，没有引起红细胞的溶血，也不会对小鼠的重要脏器带来病变性反应。

    综上所述，PXIS 具有良好的机械性能、黏附表现及生物相容性， 是一种性能全面的生物医用黏合剂。通过调整PXIS 的原料配比，可以得到具有不同固化时间、黏附强度和机械性能表现的PXIS，达到顺应特定组织的目的。

    PXIS 是一种合成简易、使用方便、作用快速且具有高黏附力和高强度的生物医用黏合剂，在组织与器官的修补及闭合中具有潜在的应用前景。

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