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    微小RNA-K1-5p调控G1/S期相关基因的表达影响内皮细胞周期

    时间：2023-02-27 08:50:04来源：百花范文网本文已影响人

    张静，彭靖淇

    卡波西肉瘤（Kaposi"s sarcoma，KS）是由KS相 关疱疹病毒（KSHV）感染内皮细胞发生的梭形细胞肿瘤［1］。多见于人类免疫缺陷病毒相关的免疫缺陷综合征（HIV-AIDS）或免疫缺陷病人［2-4］。近年来，miRNA在医学领域引起关注［5-8］，通过与mRNA的3"-非翻译区（3"UTR）结合，降解或沉默靶基因的表达［9-12］，并通过复杂机制在各种细胞过程中发挥重要作用［13-17］。之前的研究显示KSHV编码的13个miRNA，在KS中都显著上调，其中与细胞周期密切相关的miR-K1-5p上调最为明显［18-19］。G1∕S关卡是细胞周期最重要的检查点，细胞周期素依赖性激酶抑制剂4（CDKN4）、细胞周期蛋白A∕细胞周期素依赖性激酶2（Cyclin A∕CDK2）、细胞周期蛋白D2∕细胞周期素依赖性激酶4（Cyclin D2∕CDK4）均是G1∕S期调控的主要基因。自从KS细胞株（SLK）被证实为肾癌细胞来源后，便缺乏了可信赖的细胞株［20］，但是对于KSHV致瘤作用的研究，目前公认的模型是将KSHV的基因组或miRNA转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后进行基因表型检测［21-24］。本研究将miR-K1-5p转 染HUVECs，探 讨miR-K1-5p对CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的调控作用及其对内皮细胞周期的影响。本研究进行于2020年1—12月。

    1.1 细胞株和主要试剂人脐静脉内皮细胞（HUVECs，美国ScienCell生物公司）；
    RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；
    293T细胞（上海玉博生物科技有限公司）；
    Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；
    miR-K1-5p模拟物（mimics）、mimics阴性对照∕NC（武汉艾斯莱德生物科技有限公司）；
    双萤光素酶报告系统（上海碧云天生物技术有限公司）；
    Trizol（美国Ambion公司）；
    miScriptSYBR Green PCR Kit试剂盒（美国VAZYME公司）；
    细胞周期分析试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；
    CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4（美国BOSTER公司）；
    GAPDH（杭州贤至生物有限公司）。

    1.2 细胞培养与转染使用密度为80%，对数生长期的HUVECs（此细胞株广泛用于KS的研究［21-24］），以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板中，培养24 h。设立两组：miR-K1-5p mimics组和mimics NC组，使用Lipofectamine 2000将它们分别转染到HUVECs中，转染时间为48 h。

    1.3 miR-K1-5p靶基因预测使用TargetScanHuman Custom 5.2和miRDB的生物信息学软件预测miR-K1-5p的靶基因及靶基因3"UTR中的结合位点。

    1.4 双萤光素酶试验将野生型（WT）和突变型（MUT）CDKN4 3"UTR构建到双萤光素酶报告载体（pYr-miRTarget）质粒上，将质粒（1 μg）和miR-K1-5p mimics、mimics NC（50 nmol∕L）共转染到293T细胞5×104，Lipofectamine 2000转染24 h后，使用双萤光素酶报告系统分析。

    1.5 蛋白质印迹法检测转染48 h后，使用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白。根据蛋白质含量绘制标准曲线。制备5%层浓缩胶和12%分离凝胶。进行电泳，结束后将蛋白质转移到膜上，用5%脱脂奶粉封闭膜2 h，一抗CDKN4、Cyclin D2、CDK2、CDK4均稀释（1∶1 000）、Cyclin A稀释（1∶500）、GAPDH稀释（1∶1 000）在4℃下孵育过夜，HRP二抗稀释（1∶10 000）在37℃下孵育2 h；
    而后增强化学发光成像；
    灰度值分析。

    1.6 q-PCR检测转染48 h后，从细胞中提取总RNA（需1mL Trizol）。使 用miScriptSYBR Green PCR Kit试剂盒定量mRNA和miRNA表达水平。PCR反应条件为：在95℃下预变性10 min，在95℃下15 s，在60℃下60 s进行40个周期。采用2-ΔΔCt相对定量法进行数据分析。其中U6为miRNA内参引物；
    GADPH为mRNA内参引物，引物序列见表1。

    表1 引物序列

    1.7 细胞周期分析miR-K1-5p mimics、mimics NC分别转染HUVECs细胞中，48 h后收获1×105细胞，用200 μL细胞液离心5 min，用PBS洗涤细胞2次，使用细胞周期分析试剂盒检测：向细胞中添加RNase A溶液（20 μL），使用PI染料溶液（400 μL），最后使用流式细胞仪进行分析。

    1.8 统计学方法SPSS 20.0软件用于统计分析，数据经过正态性检验及方差齐性检验。正态分布的计量数据以±s表示。t检验用于单变量两组资料之间的比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。

    2.1 miR-K1-5p的表达水平miR-K1-5p mimics和mimics NC转染HUVECs细胞。48 h后，q-PCR结果显示miR-K1-5p mimics组表达水平0.91±0.08明显高于mimics NC组表达水平0.00±0.00（t=19.54，P＜0.001），40个循环未检测出∕低于检测下限。

    2.2 miR-K1-5p靶基因的预测靶基因的预测结果：TargetScan Human Custom显示有637个靶基因，miRDB显示有1 102个靶基因，取交集显示有354个靶基因。miR-K1-5p靶基因的功能主要富集在细胞周期、调节转录、表达调控等。其中靶基因CDKN4与细胞周期的调控密切相关。图1示CDKN4 3"UTR与miR-K1-5p的结合位点。

    图1 CDKN4 3"UTR与miR-K1-5p的结合位点

    2.3 miR-K1-5p靶向CDKN4基因将miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT、mimics NC+CDKN4-WT、miRK1-5p mimics+CDKN4-MUT和mimics NC+CDKN4-MUT分别转染293T细胞。24 h后测定各组萤光素酶活性，miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT组明显低于其余组的萤光素酶活性（P＜0.01）；
    转染miR-K1-5p mimics后，CDKN4蛋 白∕mRNA表 达 水 平 均 低 于mimics NC组（P＜0.01）。因此，CDKN4是miR-K1-5p直接作用的靶基因。miR-K1-5p可以负性调控CDKN4的表达。见表2。

    表2 相对萤光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相对表达比较±s

    表2 相对萤光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相对表达比较±s

    注：miR-K1-5p mimics为miR-K1-5p模拟物，mimics NC为模拟物阴性对照，CDKN4-WT为细胞周期素依赖性激酶抑制剂4野生型萤光素酶载体，CDKN4-MUT为细胞周期素依赖性激酶抑制剂4突变型萤光素酶载体。①与mimics NC组相比，P＜0.01。

    组别mimics NC miR-K1-5p mimics t值P值重复次数3 3 CDKN4-WT 0.81±0.04 0.42±0.05①17.73＜0.001 CDKN4-MUT 0.80±0.05 0.82±0.03 0.93 0.364 CDKN4蛋白0.28±0.02 0.11±0.01①12.91＜0.001 CDKN4 mRNA 1.00±0.01 0.33±0.02①47.90＜0.001

    2.4 转染后Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA的相对表达量转染48 h后结果显示：与mimics NC组相比，miR-K1-5p过表达显著增加Cyclin A∕CDK2蛋白和mRNA的表达水平（P＜0.01）。因此，miR-K1-5p可以正性调控Cyclin A∕CDK2的表达。见表3。

    实验二的词汇测试结束后，要求两组学生如实填写查阅了哪些单词，用以确定各组查阅目标词的人次，结果表明，两组学生不同程度地查阅了目标词的用法。统计结果如下：

    表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相对表达量比较

    表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相对表达量比较

    注：mimics为模拟物，mimics NC为模拟物阴性对照，Cyclin A为细胞周期蛋白A，CDK2为细胞周期素依赖性激酶2。①与mimics NC组，P＜0.01。

    组别mimics NC mimics t值P值重复次数3 3 Cyclin A蛋白0.05±0.01 0.13±0.01①10.61＜0.001 CDK2蛋白0.21±0.02 0.65±0.04①16.50＜0.001 Cyclin A mRNA 0.99±0.08 2.94±0.13①22.66＜0.001 CDK2 mRNA 1.02±0.09 1.96±0.3①5.02 0.007

    2.5 转染后Cyclin D2/CKD4蛋白及mRNA的相对表达量转染48 h后，行蛋白质印迹法和q-PCR检测Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA的表达水平。结果显示，与mimics NC相比，miR-K1-5p mimics显著增加了Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA表达水平（P＜0.05）。因此，miR-K1-5p可以正性调控Cyclin D2∕CDK4的表达。见表4。

    表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相对表达量比较

    表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相对表达量比较

    注：mimics为模拟物，mimics NC为模拟物阴性对照，Cyclin D2为细胞周期蛋白D2，CDK4为细胞周期素依赖性激酶4。①与mimics NC组，P＜0.01。

    组别mimics NC mimics t值P值重复次数3 3 Cyclin D2蛋白0.28±0.03 0.56±0.03①10.68＜0.001 CDK4蛋白0.19±0.04 0.43±0.05①7.03 0.002 Cyclin D2 mRNA 1.03±0.06 1.67±0.30①3.92 0.017 CDK4 mRNA 1.00±0.07 1.64±0.24①4.39 0.012

    2.6 CDKN4、Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的western blotting电泳图蛋白质印迹法检测结果示：mimics组CDKN4的蛋白表达水平低于mimics NC组；
    mimics组Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的蛋白表达水平高于mimics NC组。见图2。

    图2 CDKN4∕Cyclin A∕CDK2∕Cyclin D2∕CDK4蛋白质印迹电泳图

    2.7 miR-K1-5p对细胞周期的影响转染后显示mimics组的PI值（PI=S+G2期∕G1+S+G2期；
    PI为增殖活性指数，PI值越大，细胞周期变短、增殖变快）及S期、G2期比值均高于mimics NC组（P＜0.05）；
    mimics组的G1期比值低于mimics NC组（P＜0.01），见表5；
    细胞周期流式图见图3，因此，miR-K1-5p可以使细胞周期进展加速，促进细胞增殖和G1∕S期转换。

    表5 转染后对HUVECs细胞周期影响比较/（%

    表5 转染后对HUVECs细胞周期影响比较/（%

    注：HUVECs为人脐静脉内皮细胞，mimics为模拟物，mimics NC为模拟物阴性对照。

    组别mimics mimics NC 3 t值p值重复次数3 S+G2期∕G1+S+G2期23.37±0.29 15.00±0.75 18.03＜0.001 G1期76.63±0.28 85.00±0.76 17.96＜0.001 S期15.34±0.36 8.45±0.20 28.86＜0.001 G2期8.02±0.17 6.55±0.80 3.11 0.04

    图3 转染后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞周期流式图：A为mimics NC组；
    B为mimics组

    KS是一种起源于内皮细胞的血管肉瘤［25］。KSHV是7种可导致人类恶性肿瘤的病毒之一，是KS的重要致病因子［2-3］。KSHV主要通过编码miRNA对KS产生影响，KSHV miRNAs可以调节宿主细胞的分化，影响其细胞周期，最终诱导癌变发生［26-28］。研究miRNAs在KS和癌旁组织中的差异表达，结果显示69个miRNAs的表达上调；
    101个miRNA表达下调，特别是KSHV编码的miR-K1-5p表达上调最为显著［18］。因此高表达的miR-K1-5p可能在KS中发挥重要作用。GO和KEGG信号通路分析表明：miR-K1-5p主要参与细胞周期信号通路，通过它的靶基因介导信号通路发挥作用。CDKN4（miRK1-5p的靶基因）、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4是该通路中G1∕S期的关键基因，G1∕S关卡是细胞周期中最主要的调控点，因此研究miR-K1-5p对CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4的调控作用具有重要意义。

    细胞周期依赖于精准调控。调控体系中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKI、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK、细胞周期蛋白Cyclin均发挥重要作用；
    CDK结合Cyclin使细胞不断增殖、分裂；
    而CKI与Cyclin竞争结合CDK或优先结合Cyclin∕CDK复合物，发挥抑制作用。它们共同参与细胞周期的正常循环。当CKI丢失、Cyclin∕CDK表达异常、检测点发生变化，可能导致细胞周期紊乱，细胞增殖失控，肿瘤形成。CDKN4作为一种CKI因子，抑制G1期进程，负性调控Cyclin∕CDK，避免DNA错误复制。其表达减少促进瘤细胞G1∕S期转化，使大量瘤细胞进入S期，加速瘤细胞的恶性转化。Cyclin A在G1晚期表达，近年来，在许多人类肿瘤中发现Cyclin A过表达，抑制其表达，可使肿瘤细胞周期运转受阻，引起肿瘤细胞死亡，具有靶向治疗的良好前景。Cyclin D2既往研究较少，它由CCND2基因编码，由5个外显子及4个内含子构成，G1早期表达，能促进细胞增殖，在结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中可见Cyclin D2的异常表达［29］。CDK自身不与底物反应，形成CDK∕Cyclin复合物时才能表现出活性，参与细胞周期的调控，不同细胞周期时相产生不同的Cyclin∕CDK复合物，促进时相之间的转换，CDK2和CDK4是G1-S转换的主要限速因子，形成CyclinA∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4复合物促进G1-S转换。

    本研究通过双萤光素酶试验证实CDKN4是miR-K1-5p的靶基因；
    miR-K1-5p对CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4具 有 明 显 的 调 控 作 用。miR-K1-5p mimics转染HUVECs细胞后，CDKN4蛋白和mRNA表达水平均显著下调；
    Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4蛋 白 及其mRNA表 达 水 平显 著 上调。推测miR-K1-5p作为一种KSHV miRNA，在转录后通过抑制靶基因CDKN4的表达。发挥其调控细胞周期的功能。CDKN4作为G1∕S期重要监控因子，扮演交通红灯的作用，miR-K1-5p减少CDKN4表达，使其原始功能丧失，解除或减弱了对Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的抑制，细胞增殖失控，细胞周期信号通路异常激活，从而导致肿瘤的发生。此外，本研究采用PI法研究miR-K1-5p对HUVECs细胞周期的影响。如数据所示，miR-K1-5p过表达后，G1期时长减短，S期和G2期细胞数量显著增加。因此，miR-K1-5p促进了G1∕S期转变，抑制HUVECs细胞凋亡，促进HUVECs细胞增殖。

    综上，研究证实了上调miR-K1-5p的表达，减少了CDKN4表达，增加了Cyclin A和Cyclin D2的表达，提高了CDK2和CDK4的活性，使肿瘤细胞无限增殖；
    反之即可抑制肿瘤性的增殖。鉴于miR-K1-5p作为促癌基因对细胞周期具有显著的调控作用，它很可能成为KS的一个新的治疗靶点。

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