SERPINA1在肝癌组织的表达及临床意义*
彭契六,朱春玲,张 磊,韦尚谋,罗佳佳,甘丽英,张 智,韦邦宁
(1.广西国际壮医医院检验科,南宁 530201;
2.南宁市第一人民医院肝胆外科,南宁 530022;3.广西国际壮医医院肝胆外科,南宁 530201)
寻找肝癌转移复发的预警分子和预后标志物,预防和降低术后肿瘤复发转移率,已经成为肝癌研究领域的热点[1]。丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(serine protease inhibitor A1,SERPINA1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的主要成员,主要由肝细胞合成[2]。SERPINA1具有强烈的催化反应活性,主要通过与酶的活性部位结合,抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为活性酶,在调节酶活性和蛋白质代谢,以及细胞生长、分化、运动和信号转导方面发挥重要的作用[3]。近年的研究结果显示,SERPINA1与胃癌、口腔扁平细胞癌和结直肠癌的发生、发展和转移预后相关[4-6],但其在肝癌组织的表达及与肝癌患者预后的关系尚不清楚。本研究旨在分析肝癌组织中SERPINA1表达与肝癌患者术后转移和预后的关系,并在HepG2细胞系中通过慢病毒转染干扰SERPINA1表达,探讨SERPINA1对肝癌细胞侵袭和转移的影响,为肝癌转移的预防和早期干预提供新思路。
1.1 肝癌标本
选取2013年1月至2016年6月在南宁市第一人民医院肝胆外科行手术切除的肝癌病例68例和2019年1月至2019年8月在广西国际壮医医院肝胆外科行手术切除的肝癌病例10例,肝癌切除术后收集肝癌组织和癌旁组织(癌组织与正常组织交界处2 cm以内),-80 ℃保存备用。纳入的全部病例均经病理确诊为肝细胞癌。分析78例肝癌患者相关临床资料,所有纳入的病例均在入组前征得患者及其家属的知情同意。本研究经南宁市第一人民医院伦理委员会(NNSY20160503)和广西国际壮医医院伦理委员会(20181201)批准。
1.2 细胞株和试剂
肝癌细胞株HepG2由中国科学院上海生命科学研究院提供。逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司,E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自美国Abcam公司,SERPINA1抗体、荧光二抗购自美国Santa Cruz公司,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)单克隆抗体购自美国Sigma公司,24孔Transwell侵袭小室购自美国Corning公司,Matrigel购自美国BD公司。
1.3 方法
1.3.1细胞培养和细胞转染
HepG2细胞采用DMEM培养基[含10%胎牛血清(FBS)]在37 ℃ 5% CO2环境中培养,当细胞生长至汇合度60%~70%,更换新鲜的培养基并加入适量的病毒悬液,继续培养24 h后,更换新鲜培养基,用嘌呤霉素筛选稳转细胞株。SERPINA1干扰RNA(siRNA)目标序列为5′- GAA CUC ACC CAC GAU AUC A-3′和5′- GAU GAA GCG UUU AGG CAU G-3′。
1.3.2RT-PCR
Trizol一步法提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR,检测SERPINA1的mRNA相对表达量。SERPINA1上游引物:5′-GGA ACA GGC TCA GGA CTA TCT C-3′,下游引物:5′-CAA CAT CTG GCA CTC CAC A-3′;
GAPDH上游引物:5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′,下游引物:5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。以GAPDH基因作为内参,采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。
1.3.3Western blot
将组织和转染48 h后的肝癌细胞用细胞裂解法提取细胞总蛋白,BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。样品均定量为5 μg/μL,变性,取50 μg蛋白经8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,70 V 100 min 电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加入SERPINA1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9和β-actin一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜。TBST洗膜,加入相应二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,TBST清洗后,Bio-Rad ChemiDocTMXRS+ System曝光显影,Bio-rad Quantity One软件扫描胶片的灰度值进行定量分析。
1.3.4免疫组织化学检测
组织标本用石蜡包埋,切成厚度为4 μm的薄片,采用免疫组织化学法检测SERPINA1表达,染色结果以细胞胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒判断为阳性。免疫组织化学检测结果采用Greenspan分级,根据阳性细胞数和染色强度进行综合评分。每张切片在光镜下随机挑选10个400倍视野,每个视野计数100个细胞。染色信号的强度分为4级:0级为“-”,1级为“+”,2级为“++”,3级为“+++”。阳性信号的面积根据阳性区域占整体切片面积的百分比分为5级:0级为0,1级为>0~25%,2级为>25%~50%,3级为>50%~75%,4级为>75%~100%。Greenspan分级将信号面积得分与信号强度得分相乘,“-”为0分;
“+”为1~4分;
“++”为5~8分;
“+++”为9~12分。评分过程由两位不知晓样本临床资料的实验人员独立完成。Greenspan分级“-”和“+”的样本为低表达组,Greenspan分级“++”和“+++”的样本为高表达组。
1.3.5Transwell实验
取人工基底膜和无血清培养基按1∶4混匀加入Transwell小室中,凝固。无血清培养基饥饿培养24 h的HepG2细胞,无血清培养基清洗3次,将细胞悬液的细胞浓度调节为1×106/mL,每个Transwell小室下室加入500 μL含10% FBS的培养基,上室加入200 μL细胞悬液,37 ℃培养箱培养48 h。取出Transwell小室,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色5 min,PBS洗2次,用棉签擦去Transwell小室上表面细胞,显微镜下观察并计数。
1.4 统计学处理
2.1 随访结果
78例肝癌患者男58例,女20例;
年龄31~79岁,≤50岁46例,>50岁32例;
28例术前甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L,50例AFP>400 μg/L;
34例肿瘤直径>5.0 cm,44例肿瘤直径≤5.0 cm;
TNM分期Ⅰ、Ⅱ期34例,Ⅲ、Ⅳ期44例;
病理分级Ⅰ、Ⅱ级33例,Ⅲ、Ⅳ级45例;
肿瘤有包膜28例,无包膜50例;
血管侵犯34例,无血管侵犯44例;
肿瘤单发42例,多发36例。所有研究病例均获随访,随访截至2021年2月。78例行手术切除的肝癌患者随访时间2~72个月,中位随访时间28个月,5年总累积生存率17.9%(14例)。随访期间共有41例复发,复发率为52.6%。复发时间为术后2~49个月,复发中位时间为术后15个月。复发转移部位依次为肝28例、肺24例、腹腔3例、骨7例、腹膜2例、脑2例、胸膜2例、胰1例、纵隔1例、食管1例。
2.2 患者肝癌组织和癌旁组织中SERPINA1 mRNA和蛋白表达比较
肝癌组织中SERPINA1 mRNA表达明显高于癌旁组织[(1.396±0.059)vs.(1.103±0.053),t=4.872,P<0.05],SERPINA1蛋白表达亦明显高于癌旁组织[(0.894±0.086)vs.(0.583±0.095),t=5.811,P<0.01],见图1。
2.3 SERPINA1表达与肝癌临床病理特征的关系
SERPINA1主要定位于细胞质,见图2。肝癌组织SERPINA1的阳性表达率为60.3%(47/78),癌旁组织为42.3%(33/78),比较差异有统计学意义(χ2=5.03,P<0.05)。肝癌组织中SERPINA1阳性表达与TNM分期、病理分级和血管侵犯有关(P<0.05),见表1。
图2 肝癌组织SERPINA1免疫组化结果(×100)
表1 肝癌组织SERPINA1表达与临床病理特征的关系
2.4 SERPINA1表达与肝癌患者预后的关系
78例肝癌患者术后1、3、5年累积复发率分别为23.1%(18/78)、46.2%(36/78)、48.7%(38/78),术后1、3、5年累积生存率分别为83.3%(65/78)、42.3%(33/78)、17.9%(14/78),见表2。SERPINA1高表达组5年累积复发率明显高于SERPINA1低表达组(χ2=7.305,P<0.01),5年累积生存率低于SERPINA1低表达组(χ2=5.899,P<0.05),见图3。
表2 肝癌患者术后1、3、5年累积复发及生存情况比较
A:累积复发率;
B:累积生存率。
2.5 SERPINA1表达对肝癌细胞侵袭能力的影响
与对照组比较,siSERPINA1组穿过小室基底膜的细胞数量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),Mock组无明显差异(P>0.05),见图4。
图4 各组细胞侵袭能力的变化
2.6 SERPINA1表达对肝癌细胞上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的影响
与对照组和Mock组比较,siSERPINA1组E-cadherin表达上调,SERPINA1、MMP-9和N-cadherin表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。
图5 各组EMT相关蛋白表达比较
SERPINA1是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的主要成员,主要由肝细胞合成,少部分由巨噬细胞和单核细胞产生[7]。在人类基因组中,SERPINA1定位于第14号染色体上的q32.1,长度约为370 kb[8]。SERPINA1具有强烈的催化反应活性,能够与酶的活性部位结合,抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶,在调节酶活性和蛋白质代谢等方面发挥重要的作用[9]。除此之外,SERPINA1还参与了生物体内多种生理和病理反应,在调节细胞生长、细胞分化、细胞运动和信号转导中发挥作用[4]。
鉴于其重要的生物学功能,SERPINA1已经引起研究者的关注,并已成为肿瘤研究领域的热点[10]。ERCETIN等[11]研究发现,SERPINA1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且癌组织中SERPINA1表达越高,患者的生存率越低。KWON等[12]研究发现,直结肠癌中SERPINA1表达与患者肿瘤分期、淋巴结转移和预后不良相关,过表达SERPINA1增强直结肠癌细胞株侵袭和迁移的潜能,反之,沉默SERPINA1表达抑制直结肠癌细胞株的侵袭和迁移的潜能,进一步研究发现SERPINA1通过与Snail结合参与调节直结肠癌的侵袭转移。在胃癌中,JIANG等[4]研究表明SERPINA1表达与胃癌的进展有关,SERPINA1可能是预防胃癌侵袭和转移的潜在靶标。本研究采用RT-PCR和Western blot检测肝癌组织和癌旁组织中SERPINA1 mRNA和蛋白表达,结果显示肝癌组织中SERPINA1表达明显高于癌旁组织,SERPINA1表达与肝癌病理分级、TNM分期和血管侵犯相关(P<0.05),而与肝癌其他临床病理学参数无关(P>0.05),提示SERPINA1表达可能在肝癌侵袭转移中发挥着重要的作用。
本研究采用Kaplan-Meier生存曲线分析SERPINA1表达与肝癌患者术后预后的关系,结果显示SERPINA1高表达组患者5年累积生存率明显低于SERPINA1低表达组(χ2=5.899,P<0.05),5年累积复发率明显高于SERPINA1低表达组(χ2=7.305,P<0.01),表明肝癌组织SERPINA1高表达的患者可能具有更高的复发和转移的风险。为了进一步研究SERPINA1表达与肝癌细胞侵袭迁移的关系,采用RNA干扰技术在肝癌HepG2细胞中干扰SERPINA1的表达,然后应用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力,结果显示与对照组和Mock组比较,siSERPINA1组穿过Transwell小室基底膜的细胞数量明显减少,表明沉默SERPINA1的表达可以抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力,SERPINA1与肝癌细胞侵袭迁移密切相关,与KWON等[12]研究结果一致。
EMT是指上皮细胞发生成纤维细胞形态改变,转化为具有间质细胞表型的生物学过程,是胚胎发育和器官形成的基础过程[13]。大量研究结果表明,EMT在肿瘤的侵袭转移过程中也发挥着至关重要的作用,它是上皮源性肿瘤细胞转移的关键步骤[14]。EMT程序启动后,肿瘤细胞的上皮表型向间质表型转变,主要表现为上皮细胞失去细胞间黏附和细胞极性等分化表型,获得侵袭迁移和抗凋亡等间质细胞特征,同时间质细胞和上皮细胞标志物表达发生改变,如上皮标志物E-cadherin表达下调,间质标志物N-cadherin表达上调等[15]。MMPs的重要作用是降解细胞外基质,通过影响细胞外基质导致EMT,促进肿瘤细胞移动。MMP-9已被证实在不同类型的肿瘤中促进肿瘤发生、发展,并且与肿瘤的侵袭和不良预后相关[16-17]。本研究发现,上皮标志物E-cadherin表达升高,而MMP-9和间质标志物N-cadherin表达下降,表明SERPINA1可能通过调控MMP-9和EMT相关蛋白的表达,进而影响肝癌细胞的侵袭迁移。
综上所述,SERPINA1在肝细胞癌中高表达,并与患者预后相关;
SERPINA1可能通过调控MMP-9表达和肝癌细胞EMT,进而影响肝癌细胞的侵袭迁移。SERPINA1可能是预防肝癌迁移和早期干预的新的标志物。
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七推理与集合1 期中考试数学成绩出来了,三个好朋友分别考了88分,92分,95分。他们分别考了多少分
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党建基本工作有哪些(一) 基层党建工作包括哪些内容 选择了大学生村官这条路,你就与农村基层党
【名人名言】 日期:2020-08-06
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[人生赠言]城隍庙人生赠言注释
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【格言】 日期:2019-07-14
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【学习心得体会】 日期:2022-10-29
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(呼和浩特铁路局大包电气化改造工程指挥部,内蒙古呼和浩特010050)摘要:文章介绍了福生庄隧道
【学习心得体会】 日期:2020-03-05
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【学习心得体会】 日期:2022-12-07
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城管系统警示教育心得体会9篇城管系统警示教育心得体会篇1各党支部要召开多种形式的庆七一座谈会,组织广大党员进行座谈,回顾党的光辉历程,畅谈党的丰功伟绩,
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【培训心得体会】 日期:2022-09-24
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【学习心得体会】 日期:2022-08-03
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凝聚三种力量发展全过程人民民主心得体会12篇凝聚三种力量发展全过程人民民主心得体会篇1新民主主义革命是指在帝国主义和无产阶级革命时代,殖民地半殖民地国家中的
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全面从严治党的心得体会800字7篇全面从严治党的心得体会800字篇1中国特色社会主义是我们党领导
【学习心得体会】 日期:2022-12-14
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教师全国两会精神学习专题研讨交流材料6篇教师全国两会精神学习专题研讨交流材料篇1通过对两会精神深入系统的学习,作为新一代的青年人,更应该严格要求自己,贯彻落
【教师心得体会】 日期:2022-08-11
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2024年主题教育民主生活会批评与自我批评意见(38条)(范文推荐)
2023年主题教育民主生活会六个方面个人检视、相互批评意见:1 理论学习系统性不强。学习习近平新时代中国特色社会主义思想不深不透,泛泛而学的时候多,深学细照的时候少,特...
【邓小平理论】 日期:2024-03-19
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2024年交流发言:强化思想理论武装,增强奋进力量(完整)
习近平总书记指出:“一个民族要走在时代前列,就一刻不能没有理论思维,一刻不能没有思想指引。”党的十八大以来,伴随着新时代中国特色社会主义思想在实践中形成发展的历程...
【三个代表】 日期:2024-03-19
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2024年度镇年度县乡人大代表述职评议活动总结
xx镇20xx年县乡人大代表述职评议活动总结为响应县级人大常委会关于开展县乡两级人大代表述职评议活动,进一步激发代表履职活力,加强代表与人民群众的联系,提高依法履职水平...
【马克思主义】 日期:2024-03-19
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“千万工程”是总书记在浙江工作时亲自谋划、亲自部署、亲自推动的一项重大决策,也是习近平新时代中国特色社会主义思想在之江大地的生动实践。20年来,“千万工程”先后经历...
【三个代表】 日期:2024-03-19
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2024年在市政协机关工作总结会议上讲话
同志们:刚才,XX同志对市政协机关20XX年工作进行了很好的总结,很精炼,很到位,可以感受到去年机关工作确实可圈可点。XX同志宣读了表彰决定,机关优秀人员代表、先进集体代...
【邓小平理论】 日期:2024-03-18
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在全区防汛防涝动员暨河长制工作推进会上讲话提纲【完整版】
区长,各位领导,同志们:汛期已经来临,我区城区防涝工作面临强大考验,形势不容乐观。年初,区城区防涝排渍指挥部已经召开专题调度会,修订完善应急预案,建立网格化管理机...
【马克思主义】 日期:2024-03-18
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2024年镇作风整治工作实施方案(完整文档)
XX镇作风整治工作实施方案为深入贯彻落实党的二十大精神及省市区委深化作风建设的最新要求,突出重点推进干部效能提升,坚持不懈推动作风整治工作纵深发展,根据《关于印发《2...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
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2024市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案【优秀范文】
xx市优化法治化营商环境规范涉企行政执法实施方案为持续优化法治化营商环境,激发市场主体活力和社会创造力,规范行政执法行为,创新行政执法方式,提升行政执法质效,着力解...
【毛泽东思想】 日期:2024-03-18
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2024年度关于开展新一轮思想状况摸底排查工作通知(完整)
关于开展新一轮思想状况摸底排查工作的通知为深入贯彻落实关于各地开展干部职工思想状况大摸底大排查情况上的批示要求和改革教育第二次调度会议精神,有针对性做好队伍教育管...
【三个代表】 日期:2024-03-18
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2024年公路养护中心主任典型事迹材料(完整文档)
“中心的工作就是心中的事业”——公路养护中心主任典型事迹材料**,男,1976年6月出生,1993年参加工作,2000年4月调入**区交通运输局工作,大学本科学历,中共党员,现任**...
【马克思主义】 日期:2024-03-17