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    基于TGF-β/Smad信号通路探究HSF1基因对CAL-27细胞放疗抵抗作用机制

    时间：2023-03-23 17:50:06来源：百花范文网本文已影响人

    周庆梅，蔡永美，侯宪鹏

    (1.济南市妇幼保健院 口腔科，山东 济南250001；
    2.济南市妇幼保健院 儿童保健科，山东 济南250001；
    3.山东第一医科大学附属省立医院 肿瘤治疗中心放疗科，山东 济南250021)

    口腔癌通常包括口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上颌窦癌等，是头颈部肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率近年来呈现上升趋势，口腔癌发病原因尚不明确，但与吸烟、酗酒、嚼食槟榔、口腔卫生等因素有关[1]。口腔癌常见的症状为长期难以痊愈的口腔溃疡，持续存在的口腔疼痛，脸颊有肿块，牙龈、舌头或口腔黏膜上有白色或红色斑点等。口腔癌因发病初期症状不明显，因此确诊时多为中晚期。目前常用的治疗方式为放疗，但长期的放疗容易产生抵抗性，降低治疗效果[2]。口腔癌发生与基因突变相关，研究发现[3]异常高表达的热休克因子1(heatshockfactor1，HSF1)促进癌细胞的恶性行为并促进血管新生。口腔癌的发生、发展是多因素、多基因、多阶段长期演变的过程。其中，转化生长因子β(Transforming growth factor,TGF-β)具有抑制免疫应答的作用，在肿瘤中通过该作用可促进肿瘤恶性行为。Smad是TGF-β/Smad通路重要因子，参与生物学过程。研究发现[4],TGF-β/Smad通路参与多种肿瘤的产生及发展过程。目前，关于HSF1对口腔癌的作用机制及其对转化生长因子β相关通路的作用机制尚不明确，因此，本文基于TGF-β/Smad信号通路探究沉默HSF1基因诱导对口腔癌细胞放疗抵抗的作用机制。

    1.1 实验细胞及动物

    人口腔鳞癌细胞CAL-27购自上海富衡生物公司，18只雄性BALB/c裸鼠购自北京华阜康生物公司,鼠龄8-10 w，体质量在18-20 g之间，适应性喂养1 w后进行实验。本此实验已通过动物伦理委员会批准(批号：20200518)。

    1.2 实验试剂

    流式细胞仪(上海三崴公司，型号：BDFACSViaSystem)；
    PCR仪(山东莱恩德公司，型号：LD-PCR)；
    HSF1一抗(武汉菲恩公司)；
    TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7一抗(上海优宁维公司)；
    辣根过氧化物酶二抗(北京博尔希公司，货号：BHR102)；
    HSF1引物序列合成(上海生工公司)；
    TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7引物序列合成(合肥知恩生物公司)。

    1.3 口腔癌细胞培养

    将人口腔鳞癌细胞CAL-27用RPMI1640培养液常规培养，细胞数为80%～90%时胰酶消化，离心，1 250 r/min，共5 min，重悬，传代，取第4代细胞进行实验，用倒置显微镜观察其形态。

    1.4 口腔癌细胞放射线照射

    将人口腔鳞癌细胞CAL-27接种于6孔板中(1.6×105)，接种2 d后，用6Mev直线加速器作为放射源，在室温条件给予细胞6Gy剂量照射3天，同时观察细胞活力，若细胞无明显死亡，则取对数生长的细胞以8、10 Gy逐渐增加放疗剂量，反复培养照射，直到细胞在10 Gy放射下能够稳定存活，即放疗抵抗细胞株构建完成，然后用倒置显微镜观察其形态。

    1.5 慢病毒转染

    将放射抵抗CAL-27细胞分为抵抗组(放射抵抗CAL-27细胞)、NC组(放射抵抗CAL-27细胞转染空载体)、HSF1组(放射抵抗CAL-27细胞转染HSF1shRNA干扰慢病毒载体)。取放射抵抗CAL-27细胞，铺于T-25培养瓶，细胞融合率达30%-40%时加入HSF1sh-NC和HSF1shRNA干扰慢病毒载体，0.5 d后更换培养基，3 d后镜下观察，转染4 d后，加入嘌呤霉素(2 μg/mL)，培养2 w后进行实验。

    1.6 动物实验

    取18只裸鼠，分为口腔癌抵抗组(注射口腔癌放疗抵抗细胞)、沉默HSF1组(注射转染HSF1慢病毒的口腔癌放疗抵抗细胞)，每组9只。各组大鼠于腋下注射0.5 ml口腔癌细胞悬液建立模型，待肉眼可见瘤体，表示建模成功。

    1.7 检测指标

    1.7.1RT-PCR检测HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平

    TRIzol法提取总RNA，Primer5.0软件设计合成引物。逆转后的cDNA行荧光反应实验。PCR反应条件：94℃3 min;95℃30 s、52～59℃30 s、72℃30 s，以GAPDH为参照，共30个循环，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列，见表1。

    表1 引物序列

    1.7.2流式细胞仪检测各组口腔癌细胞凋亡情况

    取各组CAL-27口腔癌细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，接种到培养基中过夜，24 h后，收集细胞，PBS清洗，100 μl接种于5 ml流式试管中，5 μl的IFITCAnnexinⅤ与5 μl PI混合后染色，无光孵育15 min后与结合缓冲液(400 μl)混匀，PBS清洗，流式细胞仪测定凋亡。

    1.7.3Westernblot检测HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平

    取各组CAL-27口腔癌细胞，胰酶消化后离心5 min，取上清液，用上样缓冲液混合于PBS稀释蛋白样品中，按照4∶1的比例进行，然后在沸水浴中煮沸5 min，采用BCA法测总蛋白浓度，每孔上样蛋白量20 μg，SDS-PAGE凝胶电泳。转印缓冲液配制好后要放入4℃冰箱内预冷，然后转至PVDF膜上，在将脱脂奶粉加入其中，封闭1 h。加入HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7一抗(稀释比例1∶500)后，TBST漂洗3次，每次10 min；
    4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶2 000)，37℃孵育45 min，TBST漂洗10 min×3次，用DAB试剂盒，在1 ml水中加A、B、C液各1滴，再加于膜上，ECL化学发光试剂后凝胶成像系统分析目标条带的光密度值。

    1.7.4双荧光素酶报告基因

    构建HSF1真核表达载体[5]，将人口腔鳞癌细胞CAL-27接种至6孔细胞培养板中，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将构建好的TGF-β/Smad2/Smad3-3′-UTR-WT和TGF-β/Smad2/Smad3-3′-UTR-MUT质粒与pcDNA3.1-HSF1、pcDNA3.1空载体共转染至CAL-27细胞，根据试剂盒说明进行检测。

    1.7.5检测各组裸鼠瘤体体积

    建模成功4 w后处死裸鼠，取出瘤体，游标卡尺测瘤体长径、短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×短径2/2。

    1.8 统计学分析

    2.1 射线照射对口腔癌细胞形态的影响

    照射前，CAL-27口腔癌细胞形态无变化。放疗后，放疗抵抗口腔癌细胞株排列更加紊乱，且细胞数目明显增加，提示CAL-27口腔癌细胞产生放疗抵抗性。见图1。

    图1 放射前后口腔癌细胞形态(×200)

    2.2 HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平检测结果

    抵抗组CAL-27口腔癌细胞中HSF1mRNA、TGF-βmRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad7

    mRNA水平与NC组比较无显著差异(P>0.05)。与NC组相比，HSF1组CAL-27口腔癌细胞HSF1mRNA、TGF-βmRNA、Smad2mRNA、Smad3

    mRNA水平降低，Smad7mRNA水平升高(P<0.05)，提示HSF1转染成功，且沉默HSF1可抑制TGF-β、Smad2、Smad3表达。见表2、图2。

    表2 各组各指标相对表达量对比

    图2 HSF1mRNA相对表达量

    2.3 细胞凋亡检测结果

    抵抗组、NC组及HSF1组CAL-27口腔癌细胞凋亡率分别为(12.34±0.17)%、(12.41±0.09)%及(54.26±4.25)%，抵抗组CAL-27口腔癌细胞凋亡率与NC组比较无显著差异(t=0.891，P=0.394)，NC组细胞凋亡率低于HSF1组，组间比较差异显著(t=24.110，P<0.001)。见图3。

    图3 各组细胞凋亡情况对比

    2.4 HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白水平检测结果

    抵抗组与NC组CAL-27口腔癌细胞HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达水平较接近，组间比较无显著差异(P>0.05)。与NC组相比，HSF1组CAL-27口腔癌细胞中HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表达水平降低，Smad7蛋白表达水平升高(P<0.05)，见表3、图4。

    表3 各组各指标蛋白水平对比

    图4 各组指标蛋白水平对比

    HSF1蛋白与TGF-β蛋白呈现正相关性(r=0.623，P<0.001)，HSF1蛋白与Smad2蛋白呈现正相关性(r=0.671，P<0.001)，HSF1蛋白与Smad3蛋白呈现正相关性(r=0.592，P<0.001)，HSF1蛋白与Smad7蛋白呈现负相关性(r=-0.654，P<0.001)，见图5。

    图5 蛋白相关性分析

    2.5 双荧光素酶报告基因监测结果

    通过构建含有TGF-β/Smad2/Smad3的野生型或突变型3’-UTR片段的荧光素酶报告质粒，pcDNA3.1-HSF1与TGF-β/Smad2/Smad3的3’ UTR序列互补，双荧光素酶报告基因实验发现，与pcDNA3.1相比，转染pcDNA3.1-HSF1后野生型TGF-β/Smad2/Smad3活性升高，说明HSF1可靶向TGF-β/Smad2/Smad3表达，见表4。

    表4 双荧光素酶报告基因监测

    2.6 瘤体体积检测结果

    口腔癌抵抗组裸鼠瘤体体积(0.28±0.02)cm3明显高于沉默HSF1组裸鼠瘤体体积(0.17±0.04)cm3，组间比较差异显著(t=7.379，P<0.001)，见图6。

    图6 各组裸鼠瘤体体积对比

    根据国家癌症中心发布的数据，我国2018年口腔癌新发病例近5万人次，预估死亡病例近2.3万[6]。常见的口腔癌治疗方式为放疗，但放疗容易产生抵抗性，因此，减少放疗抵抗性、寻找新的治疗靶基因至关重要。

    HSF1具有调控细胞生物学行为的作用，参与肿瘤产生及发展的过程。研究显示[7]，HSF1在癌症的发展中具有转录调节的作用，通过调控细胞功能参与肿瘤发展。越来越多的研究证明HSFl在肝癌[8]、乳腺癌[9]、子宫内膜癌[10]等癌症中异常高表达，并随着癌症的严重程度加重而升高。研究表明，高表达的HSF1是多种肿瘤不良预后的标志，HSFl通过促进细胞的恶性转化，在肿瘤发生与发展中扮演重要角色[11]。本研究通过对口腔癌细胞进行照射后建立口腔癌放疗抵细胞，并将该细胞转染HSF1shRNA干扰慢病毒载体，抑制其表达，通过裸鼠瘤体实验发现在HSF1表达下调后，移植瘤生长受到抑制，且体积明显减小，经流式细胞仪检测结果显示沉默HSF1表达口腔癌放疗抵抗细胞的凋亡增加，说明抑制HSF1可降低肿瘤细胞的活性，促进其凋亡。这与王琼[12]的研究结果相似，即通过降低HSF1水平后，可抑制口腔癌细胞的生长与转移能力。

    TGF-β被认为是一种促癌因子，它可以促进上皮细胞间质转型，另外TGF-β可通过自分泌和旁分泌机制，激活其相关通路表达，从而参与肿瘤的产生及转移。Smads是TGF-β通路下游因子，可将TGF-β介导的信号传至细胞核内。Smads家族蛋白根据其结构和功能不同可分为3类：受体调节型Smad(Smad1、2、3、5、8)、共同型Smad(Smad4)、抑制型Smad(Smad6、7)。研究表明[13]，TGF-β/Smad信号通路与细胞凋亡联系密切,在细胞凋亡过程中，TGF-β激活Ⅱ型受体(TβRII),随后磷酸化Ⅰ型跨膜受体(TβRI),促进R-Smad(Smad2和Smad3)表达,Smad2、Smad3是TGF-β1/Smads信号通路上的正向调节因子，其C端功能域末端含有保守的磷酸化点位，可与TGF-β受体直接作用并被磷酸化之后形成异三聚体，转运到核内，通过与DNA结合，调控细胞生物学行为。Smad7是抑制型Smad，其抑制作用主要表现在为：一方面阻止TGF-β依赖的Smad2/4复合体的形成，从而抑制Smad2向细胞核的转运；
    另一方面，Smad7通过与活化的TGF-β型受体稳定结合，关闭了受体与其他配体结合的通道，直接影响磷酸化和Smad2的活化。

    研究表明[14]，HSF1在多种肿瘤中均为高表达。HSFl通过促进细胞的恶性转化，参与肿瘤的产生及发展。有报道[15]，HSF1 参与肿瘤细胞的葡萄糖代谢，推动肿瘤的产生及转移，在该代谢中发挥关键作用。本研究发现，沉默HSF1后，与口腔癌放疗抵抗细胞相比较，TGF-β、Smad2、Smad3水平明显降低，Smad7水平明显升高，且HSF1与TGF-β、Smad2及Smad3表达水平呈现正相关性，与Smad7表达水平呈现负相关性。周昊[16]等研究提示，热疗对口腔鳞癌具有一定的治疗作用，其作用机制可能是通过提高Smad7水平，促使Smad2、Smad3表达受到抑制，从而抑制了肿瘤的生长。研究表明[17]，高表达的HSF1可通过提高TGF-β水平，促进胆囊癌的增殖，加快其病情发展。本研究与上述研究结果相似，在口腔癌放疗抵抗细胞中，沉默HSF1水平后，通过降低TGF-β水平促进Smad7表达，从而抑制了Smad2、Smad3水平，抑制了TGF-β/Smad通路的激活，从而增加了口腔癌放疗抵抗细胞的凋亡。通过双荧光素酶报告基因监测结果证实TGF-β/Smad2/Smad3可能是HSF1的靶向基因。

    综上所述，沉默HSF1表达可促进口腔癌放疗抵抗细胞凋亡，降低裸鼠瘤体体积，其作用机制可能与调控TGF-β/Smad有关，可提高口腔癌放疗敏感性。

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