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    社会隔离对C57BL/6小鼠行为表征的影响*

    时间：2023-03-24 18:20:07来源：百花范文网本文已影响人

    吴 娜 肖福川 张铭昊 陈柏安1,,3 卢 静1,,3

    (1.首都医科大学实验动物部，北京 100069)(2.首都医科大学基础医学院实验动物学学系，北京 100069) (3. 首都医科大学基础医学院神经再生修复研究北京市重点实验室，北京 100069)

    实验中常用的啮齿类动物属于群居动物，它们之间需要正常的社会接触，长期隔离饲养容易产生异常的行为和生理特征。社会隔离是社会型生物隔离于其他同类或社会群体，无法达成社交需求的情形状况。有研究表明，社会隔离会导致成年雄性C57BL/6小鼠攻击性增强[1]，导致昆明小鼠和BALB/c小鼠的认知缺陷和攻击性增加，与昆明小鼠相比，BALB/c小鼠在相同年龄和隔离时间时表现出较弱的空间/非空间记忆和较低的攻击性[2]。有研究认为社会隔离会导致小鼠身体活动减少[3]，相反，也有研究认为小鼠社会隔离增加了多动症和探索行为[4]。隔离饲养的大鼠在新环境中表现出多动症[5]，攻击行为增加[6]，也有报道称，与群居饲养的大鼠相比，隔离饲养的大鼠变得不那么活跃，产生抑郁样行为[7-8]。综上所述，啮齿类动物在成长过程中，如果长期处于被隔离或孤立状态，就会在认知、情绪、行为等方面的发展上产生明显的障碍。但由于研究需要，部分实验需将动物单独饲养，致使其社会隔离。然而社会隔离实验结果各异，隔离养育引起的社会认知功能改变是矛盾的。我们认为可能与实验中使用的实验动物的品种、品系、性别及隔离时间不同有关。本研究选择C57BL/6小鼠作为研究对象，因其是实验中最常用的小鼠品系，并且大多基因编辑小鼠都是C57BL/6基因背景来源。本研究旨在综合检测和评价社会隔离对C57BL/6小鼠日常活动执行能力、学习记忆能力、自主运动能力和探究行为的影响。

    1.1 材料

    1.1.1实验动物与分组：SPF级2月龄 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号【SCXK(京) 2019-0008】。实验期间动物在首都医科大学实验动物部屏障环境【SYXK(京) 2015-0012】饲养，经首都医科大学实验动物伦理委员会审查，伦理审批号：AEEI-2015-020 。将 60只小鼠随机分为2组，每组30只，雌雄各半，对照组群居(5只/笼)饲养，隔离组单笼(1只/笼)饲养。

    1.1.2试剂与仪器：压缩纸片规格为 7.5 cm×8 cm，3 g/片，由中生北动(北京)科技发展有限公司定制。Morris水迷宫由正圆柱体水池、可以改变位置调整高度的透明水下隐蔽平台、具有追踪轨迹功能的计算机实时监测分析系统labmaze组成，水池参数为：直径122 cm；
    高51 cm；
    平台直径5 cm，水池壁颜色为深灰色，圆形隐蔽平台为透明材料制成。旷场设备由顶部开放的实验箱和追踪轨迹功能的计算机实时监测分析系统supermaze组成，实验箱是灰色有机玻璃制作的 40 cm×40 cm×40 cm的深灰色无盖箱体，底面9等分，在其正上方1.5 m处安放灯泡照明，使观察箱中心光照强度为400 lx。

    1.2 方法

    1.2.1筑巢实验：隔离组小鼠单笼饲养8周后，每个笼子里放一个3 g 的方形压缩棉片；
    对照组同龄群居小鼠暂时分开，单笼饲养，每个笼子里也放一个3 g 的方形压缩棉片。48 h后，称量所有未使用的压缩棉片质量，精确到 0.1 g，对照组小鼠恢复群居饲养。用筑巢五分评级量表评估筑巢情况，筑巢实验可用来评估实验动物的日常活动执行能力[9-10]。

    1.2.2Morris水迷宫实验：水池被N,E,S,W 4个等分点划分为：东北NE、东南SE、西北NW和西南SW 4个象限。对应N,E,S,W 4个点同一高度分别粘贴黑色三角形、正方形、圆形、五角星，在SE象限安装水下隐蔽平台，水池蓄水至没过平台1 cm，使用无毒食用漂白剂将水染成不透明白色液体，混合均匀且稳定后确保平台不可见。在NW象线池壁上标记一位置，与隐蔽平台圆心与水池圆心在同一直线上，此位置为实验小鼠入水点。将小鼠头朝池壁放入水中，训练时间90 s，记录动物找到水下平台的时间，如果90 s内小鼠未爬上隐蔽平台，视其潜伏期为90 s，在90 s后停止图像采集，将小鼠引导至隐蔽平台上20 s进行学习记忆。每只动物连续训练5 d，第6天将平台撤除，开始60 s的探查实验，记录动物穿过平台次数、进入目标象限次数、在目标象限停留时间和游泳距离等作为空间记忆的检测指标。Morris水迷宫实验广泛运用于认知功能障碍及神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症等)行为学研究中，被学界广泛认可和应用，可以综合评价小鼠空间学习记忆能力[11]。

    1.2.3旷场实验：设定相关参数和记录时间(5 min)，实验在安静的环境下进行，将小鼠放置在中央格，同时进行摄像和计时，5 min后自动停止摄像。计算机自动记录运动总距离、平均速度、中央格停留时间和穿格次数等指标。每只动物实验结束后，清除实验箱内动物的大小便，用75%乙醇擦洗箱底和四壁，以清除气味。旷场行为实验可用来评估实验动物的自主运动能力和探究行为[12]。

    1.3 统计学方法

    2.1 社会隔离对小鼠日常活动执行能力的影响

    筑巢结果显示，对照组群居饲养的C57BL/6小鼠大多数可以撕碎70%以上棉片，巢穴比较完整(图1A)，社会隔离8周的C57BL/6小鼠大多数可以撕碎50%～70%棉片，巢穴不完整(图1B)。社会隔离8周的C57BL/6小鼠筑巢得分(2.83±1.01)显著低于对照组群居饲养的C57BL/6小鼠(3.82±1.13)(图1C，P<0.01)，说明社会隔离导致C57BL/6小鼠日常活动执行能力下降。

    注：A：对照组典型图；
    B：隔离组典型图；
    C：筑巢得分，*P<0.01Note：A: Typical diagram of control group; B: Typical diagram ofisolation group;C: Nesting score，*P<0.01图1 筑巢实验结果Fig.1 Nesting experiment results

    2.2 社会隔离对小鼠学习记忆能力的影响

    Morris水迷宫结果显示：在定位航行训练阶段，随训练时间的延长，对照组寻找站台的潜伏期逐渐缩短，隔离组前两天增加，之后逐渐缩短，两组动物间比较差异有统计学意义(P<0.05，图2A)。在探索测试和记忆保留测试阶段，与未隔离组(2.00±1.97)相比，隔离组(0.93±2.07)穿过平台所在区域次数较低，差异有统计学意义(图2B，P<0.05)。进入目标象限次数隔离组(2.10±2.71)较未隔离组(5.27±2.96)更少，差异极有统计学意义(图2C，P<0.01)。目标象限停留时间百分比隔离组(14.29±18.31)较未隔离组(27.95±17.14)更低，差异有统计学意义(图2D，P<0.01)。目标象限游泳距离百分比隔离组(16.05±15.79)较未隔离组(29.55±15.66)更低，差异有统计学意义(图2E，P<0.01)。两组典型轨迹图显示，对照组穿过平台所在区域次数较多，表现出多次寻找平台，相对的社会隔离组小鼠穿过平台所在区域次数较少，学习记忆效果较差(图2F)。

    注：A：潜伏期；
    B：穿过平台所在区域次数；
    C：进入目标象限次数；
    D：目标象限停留时间百分比；
    E：目标象限游泳距离百分比；
    *P<0.05，**P<0.01;F：典型轨迹图Note:A: Incubation period; B: Times of passing through the area where the platform is located; C: Number of times to enter the target quadrant; D: Percentage of residence time in target quadrant; E: Percentage of swimming distance in target quadrant;*P<0.05,**P<0.01;F: Typical trajectory diagram图2 Morris水迷宫实验结果Fig.2 Morris water maze results

    2.3 社会隔离对小鼠自主运动能力和探究行为的影响

    旷场结果显示，隔离组小鼠的运动总路程(26 030±4 629)与对照组(21 575±4 475)相比增加，差异有统计学意义(图3A，P<0.01)。隔离组小鼠的平均运动速度(86.82±15.39)与对照组(74.10±14.89)相比增加，差异有统计学意义(图3B，P<0.01)。隔离组小鼠的穿格总次数(108.03±25.14)与对照组(86.33±25.63)相比增加，差异有统计学意义(图3C，P<0.01)。隔离组小鼠的静止时间(17.68±7.62)与对照组(25.5±15.54)相比减少，差异有统计学意义(图3D，P<0.05)。隔离组小鼠在中央区域停留时间(9.57±6.38)与对照组(10.31±6.37)相比，无统计学差异(图3E)。隔离组小鼠的典型运动轨迹图与对照组相比更复杂，运动距离更远(图3F)。

    注：A：总路程；
    B：平均速度；
    C：穿格总次数；
    D：静止时间；
    E：中间区域停留时间，*P<0.05，**P<0.01；
    F：典型运动轨迹Note:A：Total distance；
    B：Average speed；
    C：Number of transitions；
    D：Rest time；
    E：Intermediate area residence time，*P<0.05，**P<0.01；
    F：Typical trajectory图3 旷场实验结果Fig.3 the open field test

    实验用啮齿类动物是社会性物种，社会互动和组织与生存和繁殖成功密切相关。社会隔离作为一种慢性应激，可以使其产生心理、精神异常。有研究表明，青春期的社会隔离会导致持续的缺陷，包括情绪和认知失调，断奶后的小鼠社会隔离会导致注意力减少、社会联系行为受损和条件性恐惧记忆受损[3]；
    断奶后单独饲养8周的小鼠，即使再社会化后，也表现出社会认知缺陷[13]。断奶后的社会隔离还可以导致长期恐惧记忆的遗忘，这是由于EphB2介导的海马CA1区突触功能下调引起的[14]。从青春期到成年早期(产后28～70 d)的小鼠，6周的社会隔离后雌性小鼠在高架迷宫实验中产生了一种抗焦虑表型，在其他关于回避行为或恐惧条件反射等实验中没有影响[15]。有研究表明，隔离饲养的小鼠在旷场行为实验中表现出多动症[16]，青春期Wistar雄性大鼠和年轻的成年大鼠在旷场行为实验中的运动能力也增强[5]。也有研究表明，早期社会隔离降低了雌性ICR小鼠的运动性[17]。通过各种行为测试，大量研究调查了社会隔离饲养对实验室啮齿动物学习和记忆能力的影响。大多数研究表明，社会隔离饲养会损害啮齿类动物学习和记忆，产生社会认知缺陷，然而，证据并不一致。我们认为这可能是因为社会隔离期、动物的物种/种类、性别和发育阶段以及所使用的行为任务的不同导致的。

    本研究通过筑巢实验、Morris水迷宫实验和旷场实验，对C57BL/6小鼠日常活动执行能力、空间学习记忆能力和在陌生环境中的自主行为与探究行为进行了测试。在筑巢实验中，社会隔离8周的C57BL/6小鼠筑巢得分显著低于群居饲养的C57BL/6小鼠，说明社会隔离导致C57BL/6小鼠日常活动执行能力下降。在Morris水迷宫实验中，本研究发现随训练时间的延长，对照组C57BL/6小鼠寻找站台的潜伏期逐渐缩短，隔离组C57BL/6小鼠前两天增加，之后逐渐缩短，两组动物间有显著差异。与对照组相比，隔离组穿过平台所在区域次数和进入目标象限次数更少，目标象限停留时间和游泳距离更短，说明社会隔离导致C57BL/6小鼠学习记忆能力下降。在旷场实验中，与对照组相比，隔离组C57BL/6小鼠的运动总路程、平均速度和穿格总次数增加，静止时间减少，该结果表明，社会隔离增加了C57BL/6小鼠的自主运动能力和探究行为，可能是因为社会隔离增强了C57BL/6小鼠的焦虑行为。

    本研究结果表明，8周龄成年小鼠社会隔离饲养8周会导致日常活动执行能力和空间学习记忆能力下降，对陌生环境中的自主行为与探究行为增强，与对照组相比，均有统计学差异。本研究结果提示，如果实验中需要使用C57BL/6小鼠进行筑巢、Morris水迷宫或旷场实验，那么C57BL/6小鼠不适合单笼饲养。单笼饲养C57BL/6小鼠会造成其社会隔离，导致C57BL/6小鼠日常活动执行能力、空间学习记忆和探究行为的变化，影响实验结果，建议5只左右社会群居饲养。

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