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    人源H3N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的建立

    时间：2023-03-24 21:10:02来源：百花范文网本文已影响人

    姚 云，张毅峰，王帅勇，虞凌雪，朱世强，王 娟，单同领，周艳君，童 武，郑 浩，李国新，童光志，于 海,2

    （1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；
    2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

    猴子流感病毒对人类和动物健康构成了潜在威胁。流感病毒分为甲型、乙型和丙型[1]，基于遗传和抗原差异，可感染哺乳动物和鸟，在三种类型流感病毒中，甲型流感病毒被视为是最重要的病原体，临床上会导致人类和家畜的严重流行病。通过气溶胶飞沫传播的病毒会导致人类呼吸系统疾病，引起严重的肺炎甚至引发死亡。

    猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，其为单股、负链RNA病毒，基因组分节段，含有8个基因，可编码多种蛋白质。猪群感染猪流感之后临床症状主要表现为咳嗽、流鼻涕、精神沉郁、打喷嚏、高烧、嗜睡、呼吸困难和食欲下降等。不同于大多数负义RNA病毒，流感病毒基因组是在感染细胞的核内进行复制和转录的。在基因组RNA和病毒蛋白合成以后，核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein, RNP）在细胞核中合成，由病毒蛋白M1和核输出蛋白（NEP/NS2）介导输出到细胞质中。RNPs在细胞内被运送到出芽部位，即极化细胞顶端质膜上的脂质筏。而跨膜蛋白HA、NA、M2则是由通过标准的胞外途径被转运至细胞表面[2-3]。RNPs被推测为与质膜上的M1蛋白或者质膜上HA、NA和M2蛋白的胞质尾端相互作用，而后被包装成病毒颗粒[4-5]。最后，所有的病毒成分完成组装，形成子代病毒粒子，通过膜分裂的方式从顶端的质膜出芽。

    因猪的呼吸道上皮细胞同时拥有人类流感和禽流感病毒的受体，所以猪群对于人类流感和禽流感也易感，常常扮演着“基因混合器”的角色，在猪体内形成更多的重组病毒，因此可能导致新的大流行毒株。此外，与其他RNA病毒一样，流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶也很容易出错，因此突变频繁发生，并且没有能够消除这种情况的校对框架，导致无法控制合理变异病毒的进化。因而由于流感病毒的高突变率与高复制率，使得病毒能够迅速适应环境变化，从而逃脱宿主现有的免疫力，一定程度上为流感大流行奠定了基础。

    本研究成功构建了H3N2亚型SIV的反向遗传操作系统，通过序列测定、细胞病变等证明拯救出的病毒与野生毒株的生物学特性一致。本研究中H3N2亚型SIV的成功拯救为猪流感病毒的分子致病机制研究以及疫苗研发奠定了基础。

    1.1 毒株与细胞猪流感病毒A/Swine/Guangdong/164/2006（H3N2）、细胞293T、MDCK均由本实验室保存。

    1.2 实验试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；
    RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；
    磷酸缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM均购自Gibco公司；
    T4 DNA连接酶购自NEB公司；
    胶回收试剂盒购自Omega公司。

    1.3 引物设计参照参考文献[6]中的方法，利用引物设计软件，设计合成出流感病毒8个基因片段的通用引物以及反转录通用引物Uni-12（表1）。

    1.4 病毒RNA的提取及目的片段的扩增将病毒进行扩增，收取病毒液，按照相关说明书提取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模版，根据通用引物扩增H3N2亚型毒株的所有基因片段。

    1.5 重组质粒的构建、鉴定及纯化根据设计的引物进行目的基因的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳实验来鉴定扩增条带大小。胶回收目的条带，将其和PBD载体用BspQⅠ进行酶切处理，胶回收酶切产物，用T4 DNA连接酶置于16℃条件下连接过夜，继而将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，密切观察平板上的菌落生长状况，待其大小适宜时，挑取单个菌落放入LB培养基（氨苄抗性）中培养，取适量菌液进行鉴定，挑选阳性克隆送至生物公司进行序列测定。序列比对无误后，用甘油保存菌液，同时吸取适量菌液进行大量扩增，提取质粒，测完浓度标记好保存于-20℃冰箱。

    1.6 病毒的拯救将8个质粒混合加入同一个EP管中，每个质粒的量为1 μg，加入150 μL无血清的Opti-MEM培养基，吹打混匀；
    准备另一干净的EP管，吸取20 μL转染试剂Lipofectamine2000和150 μL无血清的Opti-MEM培养基加入其中，吹打混匀后作用5 min，而后将其加入到含有质粒的EP管中，充分混匀，室温作用20 min；
    期间用提前预热好无血清的Opti-MEM培养基将293T细胞清洗两遍，将作用好的混合物加入其中，轻轻混匀。24 h后，每孔加入1 mL的无血清Opti-MEM（内含8%BSA），于54 h后在镜下观察细胞状态而后收取上清液。取适量上清液接种到MDCK细胞中，待细胞在镜下出现明显病变时，收集病毒上清液保存于-20℃冰箱。

    表1 病毒全基因组通用引物Table 1 Primers for amplifying the full-length fragments of the virus

    1.7 拯救病毒的鉴定取出病毒液，选用鸡的红细胞检测血凝效价，再提取拯救病毒的RNA，反转录为cDNA，根据合成的通用引物扩增病毒的8个基因片段，纯化后送至生物公司进行序列测定，验证相关基因片段是否正确。

    2.1 H3N2亚型SIV 8个基因片段的RT-PCR扩增提取病毒RNA，反转录成cDNA，根据流感病毒的引物，扩增病毒的8个基因片段，转染至293T细胞，成功拯救病毒（图1）。

    图1 8个基因片段的扩增结果Fig.1 PCR products of 8 genes of wild strain

    2.2 重组PBD阳性质粒的鉴定H3N2亚型SIV基因片段的胶回收产物和PBD载体用BspQⅠ进行酶切处理，胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落放入LB培养基（氨苄抗性）中培养，取适量菌液进行鉴定，挑选阳性克隆送至生物公司进行序列测定，结果表明，测序结果与野生株序列一致（图2）。

    图2 8个重组质粒的菌液鉴定结果Fig.2 Identification of 8 recombinant PBD plasmids

    2.3 拯救病毒过程中的细胞病变转染54 h后，收集病毒液上清液，取适量接种至生长状态良好的MDCK细胞，密切观察细胞病变情况。与正常细胞（图3A）相比，接种病毒液48 h后的细胞（图3B）于显微镜下出现明显病变。

    图3 接种拯救病毒后细胞出现的病变Fig.3 Cytopathic effects of cells after infection of rH3N2 virus

    2.4 拯救病毒的血凝效价待MDCK细胞脱落80%-90%时，收取病毒上清液，使用新鲜的1%鸡红细胞做血凝实验，结果发现，拯救毒株与野生毒株血凝效价一致，均为23。

    2.5 拯救病毒的RT-PCR鉴定将拯救的病毒提取RNA再反转录为cDNA，以其为模版，根据通用引物扩增出8个基因片段，将其纯化后送至生物公司测序，经比对，测序结果与野生株序列一致，代表此病毒拯救成功（图4）。

    图4 拯救病毒8个基因片段的扩增结果Fig.4 PCR products of 8 genes of rescued virus

    反向遗传学技术以质粒为基础，将病毒基因组的全长互补DNA拷贝转染至易感细胞来制造重组的猪流感病毒。对于回答有关猪流感病毒生物学的重要问题，反向遗传学系统为其提供了强有力的技术支持，其中包括研究病毒蛋白的功能、病毒的毒力及致病性、病毒基因组复制和转录的机制、病毒与宿主细胞因子之间的相互作用，以及解析流感病毒的传播及其发病机制。基于反向遗传学技术拯救的重组猪流感病毒，也为开发灭活和减毒流感疫苗提供了强有力的支撑，奠定了良好的基础。

    运用遗传学技术产生重组病毒最初是针对DNA病毒而开发的，其基础是用编码病毒基因组的重组质粒转染细胞，或者用携带病毒序列的质粒与病毒基因组以及辅助病毒进行异源重组[7]。而在掌握了DNA病毒的初始遗传学方法之后，便开始了针对正义RNA病毒基因组的操作[8-9]。然而，与DNA抑或正义RNA病毒相比，对于负义RNA病毒的基因组（包括流感），其实是不太适合进行分子生物学操作，因为它们的基因组在方向上与mRNA互补，因此其本身不具有感染性[10]。它们需要依赖vRNA（s）和病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）来启动病毒的复制周期[11-12]。作为以质粒为基础的流感病毒反向遗传学，其需要参与病毒复制和转录的病毒组分RNP（PB2、PB1、PA和NP）和8个负链病毒RNA在转染至易感细胞时瞬时表达，共同产生新的重组IAV。反向遗传学和分子工程的出现改变了流感领域的发展，科研人员便可以利用基因工程拯救的重组流感病毒解决多个存疑问题。

    目前，国内SIV主要流行亚型为H1N1、H1N2和H3N2亚型[13]。现如今猪流感已经成为养猪业防控的重要病原体，其对公共卫生和人类流感的控制也构成了威胁[14]。猪对于禽流感和人流感病毒颇为敏感，因其呼吸道上皮细胞存在这两种病毒的受体，所以在猪体内，猪流感病毒和其他两种病毒之间可能会发生基因重组，形成更多的重组病毒[15]。A型流感病毒的抗原和遗传进化常常伴随着种间传播，而新宿主的进化变化则是由突变、重组等一系列过程引起的，这对于人类健康构成潜在的威胁，促使相关部门进一步实施更有系统的监测，具有重要的公共卫生学意义[16]。感染SIV后猪群的免疫力会降低，这便很容易造成SIV和其他病毒或细菌的二次以及混合感染，例如猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒以及其他致病菌，这在很大程度上影响了畜牧业经济的发展。H3N2亚型SIV反向遗传操作技术平台的建立将为流感病毒的分子致病机制的研究提供强有力的支撑，同时也为开发灭活和减毒流感疫苗奠定了良好的基础[17]。

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