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    加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠氧化应激、能量代谢及免疫平衡的影响

    时间：2023-03-25 10:40:03来源：百花范文网本文已影响人

    崔 璀 张振巍

    （1.河南应用技术职业学院， 河南 开封450000；

    2.中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院， 河南开封475000）

    根据中医的“八纲辨证”理论，慢性萎缩性胃炎属于“胃脘痛”“胃痞”范畴，其中医证型分布基本认同病位在胃，并存脾胃、肾功能失调，其中脾胃湿热证为临床常见的证型，主要临床表现为胃脘疼痛，舌苔黄厚、腻，口苦、臭，舌质红，恶心，呕吐，大便粘滞或稀溏，脉数滑。现代药理学研究证实，胃肠道功能紊乱与胃肠水液代谢机制失调有密切关系，而水通道蛋白（AQPs）是一类介导水分子快速转运的跨膜蛋白，在哺乳动物的消化系统中广泛表达，目前已发现的13 种AQP中，AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9 等在远端小肠和近端结肠中高度表达［1］，提示AQPs 的分布与胃肠道水液代谢有密切关系。临床研究发现，大多数胃肠道疾病的发病本质均为胃肠道水液代谢紊乱，而AQPs 在胃肠道疾病中的表达程度与疾病的发生、发展、转归有密切联系［2⁃3］。加味三仁汤为祛湿方剂，在三仁汤基础上增加黄芩、黄连、半夏、茯苓等中药，具有宣畅气机、清热利湿之功效，本研究从多角度的调节因子入手，考察加味三仁汤对脾胃湿热动物模型能量代谢、水液代谢、炎症因子、免疫调节因子、氧化细胞因子等的干预作用，揭示加味三仁汤对胃肠道水液代谢、能量代谢紊乱的调节机制。

    1.1 实验动物 雄性SPF 级SD 大鼠50只，清洁级，体质量180～220 g，购自河南省动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK（豫）2013⁃0002。

    1.2 试剂 AQP4 ELISA 试剂盒购自武汉中美科技有限公司；
    分泌型免疫球蛋白A（sIgA）试剂盒购自河南博瑞医疗器械有限公司；
    肿瘤坏死因子（TNF⁃α）、白细胞介素10（IL⁃10）、γ⁃干扰素（IFN⁃γ）、白细胞介素2（IL⁃2）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH⁃Px）、H＋⁃K＋⁃ATP 酶活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。56°红星二锅头，购自北京红星股份有限公司。

    2.1 加味三仁汤煎液的制备 加味三仁汤为中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院院内制剂，所有中药饮片均经过中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院药剂科张振巍副主任药师鉴定为正品，放置阴凉干燥处备用。参考《温病条辨》处方组成，加10 倍量水浸泡30 min，煎煮提取2次，每次1.5 h，合并煎液，减压浓缩至50 mL，药物质量浓度为1.8 g／mL，按照实验设计方案稀释成相应的药物质量浓度，即0.45、0.9、1.8 g／mL，置于4 ℃冷藏备用。按照《中药药理研究方法学》中人与大鼠的剂量换算公式计算给药剂量，得出大鼠每天给药剂量为9.45 g／kg，设定高、中、

    低给药剂量分别为18.9、9.45、4.725 g／kg，连续给药4 周。

    2.2 分组与建模 将50 只大鼠按照随机数字表法分为正常组，模型组，加味三仁汤低、中、高剂量组，每组10只。参考文献［4］ 报道，除正常组外，其余各组大鼠建立脾胃湿热模型，在造模前禁食12 h，自由饮水，正常组大鼠采用普通饲料喂养，饲养温度20～28 ℃，相对湿度为50%～60%。脾胃湿热动物模型采用综合因素复制法，即采用“内湿＋外湿＋生物致病因子”的综合因素复制脾胃湿热大鼠模型。高脂高糖饲料（普通饲料＋12%猪油＋8%蜂蜜）连续喂养10 d，第11 天在原来喂养的基础上将大鼠的饲养环境改为人工气候箱，在（33±2）℃、相对湿度95% 下饲养，每天上午3 h，下午3 h，并于固定时间灌胃给予红星二锅头10 mL／kg，连续8 d；
    第19 天灌胃给予大肠杆菌10 mL／kg，24 h 后加强感染1次，剂量为5 mL／kg，移出置于自然环境，第20 天各组大鼠给予普通饲料喂养，加味三仁汤各剂量组大鼠灌胃给予相应药物，连续给药14 d，观察各组大鼠一般状态及体征。

    2.3 ELISA 法检测结肠黏膜组织sIgA、AQP4 水平及血浆炎症因子、氧化应激因子水平 大鼠处死前，禁食12 h，麻醉后经腹主动脉取血于抗凝管内，3 000 r／min 离心10 min，分离得血浆，置于－20 ℃冷冻保存；
    各组大鼠脱臼处死后，迅速解剖，取大约距离肛门4 cm 处的结肠部位，PBS 冲洗，冰浴中用生理盐水将结肠部位进行冲洗，刮取结肠内膜组织，于PBS 中进行组织匀浆，匀浆液置于－20 ℃过夜备用。严格按照相关试剂盒说明书操作，检测大鼠结肠黏膜组织匀浆液中sIgA、AQP4 水平，血浆TNF⁃α、IL⁃10、IFN⁃γ、IL⁃2、MDA 水平和SOD、GSH⁃Px活性。

    2.4 能量代谢指标ATP 酶活性检测 拨片刮取各组大鼠胃黏膜并称定质量，加入49 倍量生理盐水，研磨制成质量浓度为20 g／L 的胃黏膜匀浆液，3 000 r／min 离心10 min，取上清液，加入H＋⁃K＋⁃ATP 酶激活剂，45 ℃水浴5 min，采用紫外分光光度计检测匀浆液中蛋白总量。

    2.5 统计学分析 通过SPSS 18.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用非参数检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

    3.1 大鼠一般状态及体征 正常组大鼠动作灵活，皮毛洁白光洁，大便成形；
    模型组大鼠体温升高，倦怠，反应迟钝，毛发槁枯，大便溏泄，肛周污秽较多，提示脾胃湿热证大鼠模型复制成功。

    3.2 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠结肠黏膜组织sIgA、AQP4 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织AQP4 水平升高（P＜0.05），sIgA 水平降低（P＜0.05）；
    与模型组比较，加味三仁汤各剂量组大鼠结肠黏膜组织AQP4 水平均降低（P＜0.05），sIgA 水平均升高（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表1。

    表1 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠结肠黏膜组织sIgA、AQP4 水平的影响（，n＝10）

    表1 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠结肠黏膜组织sIgA、AQP4 水平的影响（，n＝10）

    注：与正常组比较，∗P＜0.05；
    与模型组比较，＃P＜0.05；
    与加味三仁汤低剂量组比较，△P＜0.05；
    与加味三仁汤中剂量组比较，▲P＜0.05。

    3.3 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠外周血TNF⁃α、IL⁃10、IFN⁃γ、IL⁃2 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠外周血TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃2 水平升高（P＜0.05），IL⁃10 水平降低（P＜0.05）；
    与模型组比较，加味三仁汤各剂量组大鼠外周血TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃2 水平降低（P＜0.05），IL⁃10 水平升高（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表2。

    表2 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠外周血TNF⁃α、IL⁃10、IFN⁃γ、IL⁃2 水平的影响（，n＝10）

    表2 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠外周血TNF⁃α、IL⁃10、IFN⁃γ、IL⁃2 水平的影响（，n＝10）

    注：与正常组比较，∗P＜0.05；
    与模型组比较，＃P＜0.05；
    与加味三仁汤低剂量组比较，△P＜0.05；
    与加味三仁汤中剂量组比较，▲P＜0.05。

    3.4 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠血浆MDA 水平和SOD、GSH⁃Px 活性的影响 与正常组比较，模型组大鼠血浆SOD、GSH⁃Px 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）；
    与模型组比较，加味三仁汤各剂量组大鼠SOD、GSH⁃Px 活性升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表3。

    表3 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠血浆MDA 水平和SOD、GSH⁃Px 活性的影响（，n＝10）

    表3 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠血浆MDA 水平和SOD、GSH⁃Px 活性的影响（，n＝10）

    注：与正常组比较，∗P＜0.05；
    与模型组比较，＃P＜0.05；
    与加味三仁汤低剂量组比较，△P＜0.05；
    与加味三仁汤中剂量组比较，▲P＜0.05。

    3.5 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠能量代谢指标的影响与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜和骨骼肌能量代谢水平升高（P＜0.05）；
    与模型组比较，加味三仁汤各剂量组大鼠胃黏膜和骨骼肌能量代谢水平降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表4。

    表4 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠能量代谢指标的影响（U／mgprot，，n＝10）

    表4 加味三仁汤对脾胃湿热证大鼠能量代谢指标的影响（U／mgprot，，n＝10）

    注：与正常组比较，∗P＜0.05；
    与模型组比较，＃P＜0.05；
    与加味三仁汤低剂量组比较，△P＜0.05；
    与加味三仁汤中剂量组比较，▲P＜0.05。

    脾胃湿热证患者临床表现主要是消化、吸收、营养障碍等为主要证候的一系列病证［5］，脾胃湿热患者机体营养物质的消化、吸收，精微物质的传输，气血津液的转化等一系列生命过程都将受到不同程度的影响，基于此，本研究从能量代谢、水液代谢、炎症因子等角度来评价加味三仁汤对脾胃湿热证的治疗效果，以期为临床应用提供参考依据［6⁃7］。

    分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的水平决定了黏膜相关淋巴组织免疫能力的强弱［8⁃9］。IL⁃2 主要效应功能是增强吞噬细胞的抗感染机制，对机体的细胞免疫功能发挥监视作用［10］。IL⁃10 最主要的生理学作用就是限制和终止炎症反应，抑 制IFN⁃γ、TNF⁃α 等促炎因子表 达［11⁃12］。SOD 和GSH⁃Px 是机体的抗氧化酶，MDA 是氧化应激中间产物，三者的动态平衡反应机体脂质过氧化程度［13⁃14］。脾胃的能量代谢主要体现在ATP 酶活性的释放，ATP 酶的活性可以反应出机体能量代谢水平，该过程符合中医“脾主肌肉”的辩证理论［15⁃16］。

    本研究显示，采用多因素综合模式复制脾胃湿热证大鼠模型，大鼠的体征表现与临床症状具有相似性，提示模型复制成功，该结果与各免疫因子及炎症因子水平趋势一致，进一步证实模型复制成功。脾胃湿热证大鼠AQP4 水平升高，导致肠道水液代谢的紊乱，进而引起大鼠肠道水分吸收、排泄失调；
    加味三仁汤对AQP4 水平具有调节作用，并呈现剂量依赖性，提示加味三仁汤可能通过降低AQP4 水平来调节肠道水液代谢平衡。脾胃湿热证大鼠的ATP 酶活性强于正常组，这是由于机体对湿热致病因素和各种内源性调节因素作出的一种代谢性效应，酶活性的提高必然会增加细胞内ATP 的消耗，脾胃湿热证基础酶活性和基础能量代谢呈现代偿性增高；
    加味三仁汤能调节脾胃湿热证大鼠的能量代谢平衡，降低细胞内ATP 的消耗。

    综上所述，加味三仁汤可促进结肠黏膜组织的修复，升高sIgA 水平，进而达到修复结肠黏膜的机械屏障和免疫屏障的目的；
    同时加味三仁汤还能通过降低AQP4 水平来调整肠道水液代谢；
    升高抗炎因子IL⁃10 水平，降低炎症因子TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃2 水平，调节机体氧化应激因子水平来平衡机体免疫，降低炎症反应；
    通过调节能量代谢减轻机体能量的过度消耗进而实现治疗目的。

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