上海青中9种抗生素的超高效液相色谱-串联质谱测定
刘宏伟,杨名平,江锋,苏国成,周常义
(1.集美大学海洋食品与生物工程学院,福建 厦门 361021;
2.厦门中集信检测技术有限公司,福建 厦门 361100)
目前,全球抗生素年使用量超过10万t,这日益增加了人们对农业生态系统污染问题的担忧[1-2]。中国是世界上最大的抗生素生产国和消费国,随着抗生素在畜牧业生产中的广泛应用,含有抗生素的禽畜粪便通常被作为肥料施用于土壤中[3],大量抗生素通过排泄的方式进入到环境基质中,继而也可能从土壤转移到作物,对人类的身体健康构成潜在危害[4-5]。最终,抗生素通过动物粪便被引入土壤[6-7],导致土壤中抗生素残留日益增加。因此,畜牧业抗生素的广泛使用是导致农业环境污染的主要因素之一[8]。
Pan等[9]在我国黄淮海平原4个省(市)收集了105个土壤样品,包括13组土壤剖面样品和23对温室及露地表层土壤样品,检出的抗生素有四环素类、喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类,抗生素总质量比为1.62~575 mg/kg。Zhang等[10]为研究长期施用有机肥导致的抗生素污染,对我国东部、西部地区125个表层土壤进行了多种抗生素的采样分析,结果表明,农用地抗生素浓度的累积量显著高于常规露地。Zhang等[11]采集中国8个省份的50份粪便和堆肥样品,检测发现,在鸡粪样本中四环素质量比高达417 mg/kg。有人报道了动物粪便中普遍存在的氟喹诺酮类残留[12-15]。潘霞等[16]剖析了在种植水果蔬菜的土壤中使用畜禽粪便制成的有机肥料后,发现不同作物的表层土壤中蓄积的氯霉素类含量占比不同,最高可达30.3%。
抗生素通过畜禽粪便施肥及废水灌溉农田进入土壤后,会在土壤与植物之间发生迁移转化。研究发现,使用含有畜禽粪便废水灌溉的农田土壤中生长的植物,其组织内可以检测到一定量的抗生素。Dolliver等[17]在粪肥改良土壤生长的玉米、生菜和马铃薯中检测到了μg/kg~mg/kg(干重)水平的磺胺二甲嘧啶。Kang等[18]检测了粪肥改良的土壤中生长的11种蔬菜中的5种抗生素,其中磺胺二甲嘧啶、金霉素、泰乐菌素等抗生素在植物组织中的浓度都在μg/kg水平。Hu等[19]研究了使用畜禽粪便施肥过的田地,发现油菜、香菜、胡萝卜、芹菜等对11种抗生素有吸收积累的情况,在蔬菜中检出浓度较高的抗生素是土霉素和四环素,分别为76.8和79.3 μg/kg。
我国已经制定了肉类食品中抗生素最大残留限量标准及其检测方法[20],但对于蔬菜中抗生素含量尚未出台相关检测标准。因此,本研究选取9种常用的抗生素,研究多种抗生素在上海青中残留同时测定的检测方法,为抗生素多残留的定量分析和安全风险评估提供理论依据。
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂
乙腈,色谱纯/分析纯,德国默克试剂公司;
氯化钠、无水硫酸钠,分析纯,西陇科学股份有限公司;
甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸,分析纯,德国默克试剂公司;
甲酸,色谱纯,德国默克试剂公司;
氧氟沙星(>99%)、达氟沙星(>99%)、洛美沙星(>99%)、培氟沙星(>99%)、环丙沙星(>99%)、恩诺沙星(>99%)、氯霉素(>97%)、甲砜霉素(>97%)、氟苯尼考(>97%)均购自赛飞尔公司;
氯霉素-D5 标准品(100 mg/L,1 mL),农业部农产品质量标准研究中心。
1.1.2 主要仪器
UItiMate 3000型超高效液相色谱仪,TSQ Endura型三重四极杆质谱仪,均为赛默飞世尔科技有限公司。
1.1.3 样品来源
上海青购自厦门市同安区蔬菜市场。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
准确称量上海青2 g(精确至0.1 g),置于干净的50 mL具盖离心管中,加10 ml乙腈溶液、5.0 g无水Na2SO4、3 g NaCl进行盐析,涡旋1 min,超声提取10 min后,8 000 r/min离心3 min,充分分离。取上清液置于另一干净的50 mL具盖离心管中。离心后的残渣再加入10 mL乙腈提取溶液。重复上述步骤,合并提取液,加入0.1 g C18、0.1 g PSA粉末,涡旋1 min,5 000 r/min离心3 min,将上清液全部转移到50 mL空白具盖离心管中,40 ℃加热氮吹至近干,用1.0 mL 质量分数为0.1%的甲酸-乙腈溶液复溶,过0.22 μm有机滤膜,供UPLC-MS/MS检测。
1.2.2 液相色谱-串联质谱条件
1.2.2.1 液相色谱条件
正离子模式。流动相:C为质量分数0.1%甲酸的超纯水,D为乙腈。梯度洗脱程序:0~1 min,D质量分数为5%;
1~11 min,D质量分数为5%~84%;
11~11.5 min,D质量分数为84%~95%;
11.5~12.5 min,D质量分数为95%;
12.5~13 min,D质量分数为95%~5%;
13~16 min,D质量分数为5%。
负离子模式。流动相:A为超纯水,D为乙腈。梯度洗脱程序:0~0.5 min,D质量分数为20%;
0.5~3.5 min,D质量分数为20%~95%;
3.5~4.3 min,D质量分数为95%;
4.3~4.5 min,D质量分数为95%~20%;
4.5~7.0 min,D质量分数为20%。
1.2.2.2 质谱条件
离子源为电喷雾电离ESI+和电喷雾电离ESI-;
喷雾电压为3.5 kV(ESI+)和3.2 kV(ESI-);
鞘气压为35 Arb(ESI+)和30 Arb(ESI-);
辅助气压为15 Arb(ESI+)和10 Arb(ESI-);
离子传输管温度为320 ℃(ESI+)和300 ℃(ESI-);
喷雾温度为300 ℃(ESI+)和250 ℃(ESI-)。
2.1 质谱条件优化
色谱仪的优势在于能够较为准确地从混合物中分离出目标化合物,但是物质的具体结构信息却很难得到,所以质谱仪主要依靠样品与标准物的对比来对未知物质进行分析。因此,在进行质谱分析之前,质谱仪要先建立标准物质的数据库,才能高效、高选择性、高灵敏度地进行分析。常见的质谱仪主要有磁偏转式质谱、四极杆质谱(Q-MS)、离子阱质谱(IT-MS)、飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)5种类型。本文使用赛默飞世尔公司 UltiMate 3000 超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪进行分析。
为获得最佳灵敏度和分离效果,对12种单标溶液依次采取蠕动泵注射的方式进行一级质谱扫描,扫描结果如图 1~图2 所示。
由图1~图2可见,在正离子模式下,喹诺酮类抗生素形成稳定的峰,氯霉素类抗生素在负离子模式下形成响应强且稳定的峰。依次优化碰撞电压和射频透镜电压,选取丰度较高的母离子、子离子,最终确定定性定量离子和碰撞电压的质谱数据(见表1)。
表1 9种抗生素及抗生素内标的 UPLC-MS/MS 分析优化参数
2.2 提取条件优化
参照文献[21]喹诺酮的提取方法和文献[22]多种抗生素的提取方法,由于9种目标抗生素的理化性质差异较大,本研究在优化提取溶液时,使用加标样品比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸4种不同的提取溶剂,结果表明,乙腈溶液在同时提取氯霉素类和氟喹诺酮类抗生素时的回收率最高,结果如图3~图4所示。
2.3 净化方法优化
样品经过萃提过程,实际上已经初步去除部分干扰物质,但仍需净化处理。蔬菜中的农药兽药残留检测常用的净化方法包括固相萃取法和QuEChERS法,本文QuEChERS法使用PSA和C18 2种材料作为吸附剂,固相萃取法选择固相萃取柱HLB(60 mg,3 mL)。C18材料具有疏水性特点,其有效组分为十八烷基的硅胶键合物,对去除提取液中脂肪和非极性成分具有良好的效果[23]。PSA材料有效组分为极性官能团的硅胶键合物,能与弱阴离子交换,也可吸附极性物质,对色素、有机酸和金属离子含量较高的样品有很好的净化效果[24]。Oasis HLB是一种反相固相萃取柱,它能很好地保留酸性、碱性和两性化合物;
填料是一种多孔共聚物,其成分是亲水性N-乙烯基吡咯烷酮和亲脂性二乙烯苯,因此对目标化合物的富集效果要优于其他固相萃取柱[25]。
本文以上海青为基质,比较了固相萃取法和QuEChERS法对9种化合物的净化情况,结果见图5~图6。结果表明,相比于QuEChERS法固相萃取法,培氟沙星、甲砜霉素的回收率略低。原因是加入样液后,与水或乙腈这些极性较大的溶剂同时存在,柱压升高,柱体堵塞,回收率降低。
2.4 方法学验证
2.4.1 基质效应
基质效应是液相色谱-串联质谱定量分析中产生误差的重要来源,任何一种物质的检测都无法避免基质效应产生的干扰现象[26]。按照优化的实验方法,以空白基质样液与纯溶剂中抗生素峰面积的比值评价基质效应[27-31],计算公式为:基质效应/%=Am/As×100。其中:Am为基质样液中抗生素峰面积;
As为纯溶剂中抗生素峰面积。比值越接近100%,基质对检测分析影响越小;
比值大于100%,基质对检测分析有增强效应;
比值小于100%,基质对检测分析有抑制效应[32]。
按照节1.2的方法对空白样品进行前处理,然后配制空白基质标准溶液和纯溶剂标准溶液,测定基质效应。结果表明,对上海青中抗生素检测分析发现,除培氟沙星表现为较强的基质增强效应外,其他抗生素则均表现出基质弱抑制效应(见图7)。
2.4.2 检出限、定量限、线性范围
如表2所示,在优化实验条件下,用空白样品提取液将混合标准储备液稀释,配制成0.1~100 μg/L系列基质匹配标准溶液。各目标物在线性范围内呈良好的线性关系,相关系数r均大于0.99,独立测定样品7次,测定其标准偏差,按照文献[33-34]计算出目标物的检出限(limit of detdction,LOD)为0.02~2.49 μg/kg,定量限(limit of quabtitation,LOQ)为0.06~9.95 μg/kg。
表2 空白基质中9种抗生素的线性方程、相关系数、检出限及定量限
2.4.3 回收率和精密度实验
按照节1.2的实验方法进行样品前处理,用上海青的空白基质为样品,添加10,50,100 μg/kg 3种添加水平,每个添加水平平行测定7次,计算平均回收率和相对标准偏差。9种抗生素在10,50,100 μg/kg 3个添加水平下的回收率为76.6%~123.7%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)(n=7)为0.3%~11.0%,方法精密度高(见表3)。
表3 9种抗生素在样品中的回收率及相对标准偏差(n = 7)
2.5 实际样品测定
从厦门市农贸市场随机购买10份上海青样品,采用本方法对9种抗生素进行分析测定。结果表明,7份检出达氟沙星1.05~5.28 μg/kg,2份检出环丙沙星1.29,1.75 μg/kg,1份检出恩诺沙星2.25 μg/kg,其余抗生素均未检出。陈乾等[35]对4种市售蔬菜进行检测,抗生素残留范围为1.59~32.01 μg/kg,本研究测得数值低于该文献的结果。
表 4 实际样品中各样品的9种抗生素残留量平均值及其标准差
本文以上海青为实验对象,通过优化样品前处理和质谱条件,建立同时测定上海青中 3 种氯霉素类和 6 种喹诺酮类抗生素残留UPLC-MS/MS检测方法。该方法操作简单、净化效果好,适用于上海青中氯霉素类和喹诺酮类抗生素的检测。
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2024年度关于开展新一轮思想状况摸底排查工作通知(完整)
关于开展新一轮思想状况摸底排查工作的通知为深入贯彻落实关于各地开展干部职工思想状况大摸底大排查情况上的批示要求和改革教育第二次调度会议精神,有针对性做好队伍教育管...
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“中心的工作就是心中的事业”——公路养护中心主任典型事迹材料**,男,1976年6月出生,1993年参加工作,2000年4月调入**区交通运输局工作,大学本科学历,中共党员,现任**...
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