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    基于网络药理学与分子对接探究红景天苷治疗勃起功能障碍的作用机制

    时间：2023-06-28 21:45:03来源：百花范文网本文已影响人

    陈宣谕 张存明 马健雄 吴忠标 叶妙勇

    红景天是景天属多年生草本植物的根茎，《晶珠本草》记载红景天根茎入药有清热解毒、扶正固本之功效，而红景天苷则是红景天中的主要活性成分，现代药理学研究表明其具有多种药理学活性，包括心血管系统及神经保护、抗炎、抗氧化、抗癌、抗代谢失调等[1-2]。勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）指男性持续性或反复发作3 个月以上不能获得和/或维持必要的阴茎勃起完成性交，是最为常见的男性性功能障碍，约半数男性在40～70 岁之间均会呈现不同程度的ED[3-4]。中药治疗ED 有着数千年的历史，现代药理学研究表明，以红景天为君药的益气活血方可显著改善神经损伤大鼠ED，并且红景天苷能够调控自噬改善大鼠ED[5-6]，而其作用靶点与机制尚未明确。因此，本研究通过系统生物学为基础的网络药理学方法联合基于理论模拟评估的分子对接方法，对红景天苷治疗ED 的可能靶点与机制进行探索，为红景天苷的基础研究与药物研发提供更多依据。

    1.1 数据库及软件 PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）、pharmMapper（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）、STRING 蛋白互作信息网站（http://string-db.org/）、SEA（Similarity ensemble approach）预测网站（http://sea.bkslab.org/）、Draw Venn Diagram 网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、CTD 疾病基因数据库（http://ctdbase.org/）、人类孟德尔遗传数据库OMIM（https://omim.org/）、DisGeNet 疾病基因相关网站、比较毒理学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https://ctdbase.org）、AutoDock vina 软件、R 语言4.1.0、Cytoscape 3.8.0 软件（http://cytoscape.org/）。

    1.2 红景天苷作用靶点 从PubChem 数据库获得红景天苷的SDF 文件后导入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 网站进行预测分析，设置种属为“Homo sapiens”进行靶点预测。此外将SDF 获得的SMILES 分子表达式导入到Similarity ensemble approach 预测网站筛选出药物相关人类相关的靶点基因[7]。

    1.3 ED 相关靶点收集 GeneCards 数据库、人类孟德尔遗传数据库OMIM、DisGeNet 疾病基因相关网站、CTD 疾病基因数据库设置推理分值最低为30，将上述数据库获得的ED 相关靶点基因合并后删除重复值共获得疾病相关靶点。

    1.4 红景天苷与ED 交集靶点筛选及蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）网络构建 将红景天苷的相关靶点与ED 相关靶点上传至Draw Venn Diagram 网站进行韦恩图绘制，并获得交集基因。交集基因上传至STRING 网站，设置medium confidence=0.4，获得PPI 网络并传输至Cytoscape 3.8.0 软件后根据蛋白degree 值进行可视化作图，由内向外degree 值由高至低。此外红景天苷-京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路-作用靶点相互关系使用Cytoscape 进行可视化。

    1.5 交集靶点功能富集分析 使用R 语言中clusterprofiler 包对红景天苷-ED 共同靶点基因进行基因本体（gene ontology，GO）注释及KEGG分析，结果以气泡图及柱状图呈现。GO 功能注释包括生物途径（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）以及细胞定位（celluar component，CC）。

    1.6 核心靶基因挖掘 Cytoscape 3.8.0 软件中使用Molecular Complex Detection（MCODE）与Cytohubba插件挖掘红景天苷作用于ED PPI 网络的核心模块与基因[8]，插件参数设定均默认。MCODE 根据边与节点关系，从而寻找出能够挖掘PPI 中的核心模块。Cytohubba 插件使用最大临近成分（maximum neighborhood component，MNC）、最大团块中心（maximal clique centrality，MCC）、以及相互程度拓扑算法对PPI 进行分析，分别获得前十的靶点互作网络进一步取交集。

    1.7 红景天苷与核心靶基因分子对接 采用Molecular Operating Environment（MOE）软件进行分子对接，选取Cytohubba 与MCODE 分析出的核心靶点蛋白与红景天苷进行对接，使用PubChem 数据库获得红景天苷化合物的二维结构式SDF 文件，红景天苷的SDF 文件导入MOE 进行能量最小化操作。靶点蛋白结构来自蛋白数据库（protein data bank，PDB），将获得的PDB 结构去水分子后进行预处理，将预处理的蛋白结构与红景天苷的结构文件进行全原子模拟对接，获得对接的二、三维结构示意图以及分子结合能。

    2.1 红景天苷作用靶点 PubChem 数据库获得红景天苷的SDF 文件导入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 网站进行预测分析，设置种属为“Homo sapiens”进行靶点预测。此外将SDF 获得的SMILES 分子表达式导入到SEA 网站，并筛选出药物相关人类相关的靶点基因。将上述数据库获得的药物相关靶点基因合并后删除重复值共获得药物相关靶点379 个。

    2.2 ED 相关靶点收集 GeneCards 数据库中获取ED 相关靶点1700 个，人类孟德尔遗传数据库获得的ED 相关靶点15 个，DisGeNet 疾病基因相关网站获得ED 相关靶点256 个，CTD 疾病基因数据库获得ED 相关靶点1585 个，将上述数据库获得的ED相关靶点基因合并后删除重复值共获得疾病相关靶点2869 个，与红景天苷的药物相关靶点取交集得到142 个交集基因（见图1）。

    图1 疾病及药物潜在靶点

    2.3 核心靶基因网络图及分析 STRING 网络得到交集基因的PPI 网络图有142 个网络节点，1304 条相互作用的网络图（见图2），并对蛋白网络节点相互作用大小进行排序，其中排名前十的节点为AKT1、GAPDH、VEGFA、IL6、EGFR、SRC、CASP3、HSP90A -A1、HRAS、ESR1。

    图2 红景天苷作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

    Cytohubba 的拓扑分析算法共获得VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1、AKT1、IGF1R、MMP9、EGFR 核心靶基因共12 个（见图3A），MNC、MCC、Degree 的交集靶点8 个，包括VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1。MCODE 分析得分最高的两个模块，分数分别是22.6 与6.296。两个模块均包含了使用Cytohubba中分析得到的8 个核心靶基因，表明VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1的重要功能（见图3B、3C）。

    图3 Cytohubba 与MCODE 分析核心靶点

    2.4 交集靶点功能富集分析 GO 富集分析上述142 个交集基因，获得GO 富集的结果以调整后的P值进行排序，并使用R 语言绘制柱状图（见图4），其中GO 富集的生物过程（biological process，BP）主要涉及肌细胞增殖、细胞氧化应激反应、氧化应激反应、类固醇激素的反应、活性氧反应等；
    GO 富集的分子功能（molecular function，MF）主要涉及囊腔、胞质囊腔、膜筏、膜微结构域等；
    GO 富集的细胞组分（cellular component，CC）主要涉及核受体激活、转录因子激活-直接配体调控序列特异性DNA 活性、蛋白酪氨酸激酶活性、肽活性等。交集基因的KEGG 富集分析结果根据调整后P 值进行排序后使用R 语言绘制气泡图（见图5），主要包括PI3K-AKT 信号通路、癌症蛋白聚糖通路、Rap1 信号通路、肝细胞癌通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、前列腺癌通路、HIF-1 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抵抗通路、膀胱癌等，其中PI3K-AKT 信号通路的GeneRation 为0.213，涉及该条通路的差异基因包括AKT1、AKT2、、CDK2、CDK6、EGFR、EPHA2、ERBB4、、FGF1、FGF2、FGFR1、GSK3B、HRAS 等。

    图4 红景天苷治疗ED 靶点的GO 富集分析

    图5 红景天苷治疗ED 靶点的KEGG 富集分析

    2.5 红景天苷与ED 关键靶点的分子对接 红景天苷与Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的分子结合能分别为-5.8730、-6.3824、-6.7591、-5.5853、-5.9959 kcal/mol（见表1），分子结合能数值越小表明二者的结合程度紧密，能够发挥更强的相互作用，其中结合能<-5 表示二者对接程度较好。红景天苷与Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的对接程度均较好，二、三维对接图表明红景天苷处于Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、VEGFA 的活性口袋，因此对红景天苷的包裹更佳（见图6）。

    图6 药物-核心靶点对接图

    表1 红景天苷与靶基因结合能

    ED 中医谓之“阳痿”，表现为阴茎无法勃起、勃而不坚、坚而不久，从而导致无法获得满意的性交[9]。前期研究表明红景天为君药的益气活血方能够引气血入下焦起痿，改善海绵体神经损伤后大鼠ED，而红景天苷作为红景天主要活性成分能够调控自噬改善海绵体神经损伤大鼠ED[5-6]，但是否有其他的作用靶点及机制仍需明确。现代网络药理学结合分子对接的方法能够较为全面地挖掘中药作用机制并初步阐明中药药理学作用机制[10]。

    阴茎海绵体内皮细胞与平滑肌均可分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGFA 是VEGF 家族研究最为广泛的亚型，作为一种多功能糖蛋白，可促进海绵体平滑肌与内皮细胞的增殖，促进血管生成，刺激内源性NO 的产生维持阴茎勃起[11]。此外，ED 男性患者与雄性大鼠分别与正常对照比较，VEGFA 的表达量减少，因此VEGFA可能是治疗ED 的重要靶点[12]。本研究显示，VEGFA靶点富集显著，而Ariyanti 等[13]研究表明红景天苷能够改善糖尿病患者下肢缺血并发症，通过促进VEGFA 分泌增强内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移潜能，诱导新生血管生成及血流灌注恢复，因此VEGFA 可能是红景天苷治疗ED 的重要治疗靶点。

    阴茎海绵体细胞的过度凋亡会引起ED，因此抑制凋亡达到治疗ED 的目的[14]。Caspase 家族成员在细胞凋亡信号转导中发挥主导作用，尤其是Caspase3 作为细胞凋亡执行者，而红景天苷与Caspase3对接活性良好。目前大量研究显示红景天苷能够抑制细胞凋亡[15-16]，此外红景天苷能够抑制低氧诱导的Caspase3 表达进而改善大鼠海绵体平滑肌细胞凋亡[17]。

    合并糖尿病、高血压及神经损伤的ED 患者可出现阴茎海绵体平滑肌细胞由“收缩型”向“合成型”的表型转化，由于维持阴茎舒张和收缩功能的基本单位受损从而产生ED[18]。Okumu 等[19]对新生大鼠连续使用己烯雌酚干预6 d、21 d 后出现永久性阴茎畸形，阴茎实时荧光定量PCR 显示雌激素受体1（ESR1）表达均明显增加，肌球蛋白重链11（MYH11）mRNA 与蛋白表达量降低，同时α 平滑肌肌动蛋白免疫组化染色表达减少，表明大鼠海绵体平滑肌细胞分化受到阻碍，然而使用ESR 拮抗剂后上述表性改变得到逆转，因此ESR 通路可通过调控阴茎海绵体平滑肌细胞分化维持正常阴茎形态。研究表明，红景天苷可调控大鼠体内、外缺氧诱导的阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化[20]，而从雌激素及其受体通路着手研究海绵体表型转化与ED 的研究尚未见报道。

    KEGG 通路富集分析结果显示，红景天苷治疗ED 的分子机制与PI3K/AKT 信号通路相关，并且该信号通路富集的基因最多，同时AKT1 是交集蛋白互作中最显著的靶点，提示红景天苷可能通过PI3K/AKT 通路治疗ED。基础研究表明，PI3K/AKT 与ED密切相关，其中代谢综合征与糖尿病诱发ED 的大鼠可通过调控阴茎海绵体内PI3K/AKT 促进eNOS（Ser1177）磷酸化水平及内皮细胞增生，从而提高NO 与cGMP 的含量改善勃起功能[21-22]。

    综上所述，本研究表明红景天中的主要成分红景天苷能够通过多成分-多靶点-多通路治疗ED，为红景天进一步实验研究和临床应用提供了新方向与思路。通过分子对接验证发现，红景天苷与五组靶标蛋白结合性较好，且红景天苷处于靶标蛋白的活性口袋。基于网络药理学研究药物分子靶点治疗疾病仍存在不足，其能够系统预测作用靶点及通路，但是仍需要通过开展体内与体外实验进行验证。

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