CRISPR/Cas9系统技术难关：脱靶效应及其优化方法

于宗菲 翁丽涵 孙诚诚 曹晓钰 叶 振

1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床与基础医学院，山东 济南 250117；
2. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）第二附属医院中心实验室，山东 泰安 271000

作为第三代基因编辑技术，CRISPR/Cas9 系统在基因编辑特异性以及效率方面的优越性赶超锌指核酸内切酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activatorlike effectors nucleases，TALENs），但其存在的脱靶问题至今仍未完全解决，严重限制了CRISPR/Cas9系统的进一步发展。在生物体研究中，脱靶意味着基因编辑的准确性低，基因治疗效果得不到保证。目前，科学家们仍致力于开发和研讨如何使脱靶效应最小化。因此，亟需明确CRISPR/Cas9 系统潜在的可产生脱靶效应的环节，并对此制定降低脱靶效应的策略，解决了脱靶效应的限制，CRISPR/Cas9 系统基因编辑潜力会得到更充分的发挥。

1.1 CRISPR/Cas系统概述

CRISPR作为基因编辑领域3大编辑工具之一，经证实为细菌和古细菌免疫系统的防御武器。CRISPR/Cas 系统由成簇的规律间隔短回文重复基因序列CRISPR与Cas基因家族共同组成。CRISPR基因序列主要包括3部分：基因前端的前导序列、短而高度保守的重复序列以及大量间隔序列。CRISPR 通过间隔序列与靶基因进行识别并形成分子记忆，当相应的外源DNA 再次入侵时，CRISPR/Cas 系统可发挥精准靶向作用［1］。Cas 基因也称CRISPR关联基因，位于CRISPR基因周围或分散在基因组其他位点，编码的蛋白可与CRISPR 序列发生作用。根据编码蛋白的不同可将CRISPR/Cas 系统分成单Cas蛋白复合体和多Cas蛋白复合物2类，分别包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型［2］。其中Ⅱ型CRISPR/Cas 系统中的Cas9蛋白已广泛应用于基因工程。

1.2 CRISPR/Cas9的作用原理

第一步：俘获外源基因。Cas1和Cas2蛋白识别出首次入侵的外源DNA 的前间隔区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）区域，选取与PAM邻近的靶基因进行切割，进而将这一靶基因序列整合至CRISPR 序列前导区下游，作为一种分子记忆来防止同一外源基因的后续入侵［3］。第二步：sgRNA-Cas9 复合物的合成。CRISPR 基因进行表达，在前导区的调控下，CRISPR 序列转录形成前体crRNA（precursor RNA， pre-crRNA）和 反 式 激 活CRISPR RNA （trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA），随后pre-crRNA 在RNase Ⅲ核酸酶的加工剪切下成熟。成熟的crRNA（CRISPR RNA）与tracrRNA 结合组成sgRNA， Cas 蛋白与sgRNA 组成最终的复合物［4］。第三步：靶向干扰。复合物通过与识别出的PAM 序列相结合。由Cas9 酶的HNH（作用于与crRNA 互补的链）和RuvC（作用于非互补链）核酸酶结构域切割入侵基因［5］，DNA 双链被解开，形成“R-Loop”（图1）。当存在同源DNA 序列时，断裂位点可进行精确的同源重组修复（homology directed repair，HDR）。源DNA 序列时，断裂位点将依靠DNA 连接酶进行非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）［6］。

图1 CRISPR/Cas9系统的作用原理

1.3 CRISPR/Cas9系统在医学肿瘤领域的应用

CRISPR/Cas9系统促进肿瘤基因水平治疗突破性发展，如构建肿瘤模型、靶向敲除癌基因致病位点、恢复抑癌基因活性、减少肿瘤细胞耐药性、进行肿瘤免疫治疗等。Ciampricotti 等［7］使用CRISPR/Cas9 体细胞编辑技术获得RLF-Mycl 基因融合的小细胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC）小鼠模型，与人类RLF-MYCL SCLC 的基因表达相似。RLFMYCL融合加速了小鼠SCLC的转化和增殖，增加了转移性传播和转移部位的多样性。研究发现，利用CRISPR 技术敲除肺癌患者程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）可促进T 细胞启动免疫反应肺癌［8］。Dong 等［9］发现敲除RNA解旋酶DHX37 基因可提高抗原特异性CD8+T 细胞对 三 阴 性 乳 腺 癌（triple negative breast cancer，TNBC）免疫治疗靶点上的有效性。Kim 等［10］使用CRISPR 技术编辑的CD33 基因敲除的造血干细胞和原代细胞可以产生功能性造血，但对抗原靶向治疗有抵抗力，不受CD33靶向CAR-T细胞的影响，使CAR-T 细胞免疫治疗急性髓系白血病成为可能。Wang等［11］对TNBC小鼠模型进行体内CRISPR基因剔除（knockout， KO）筛选发现，在癌细胞中删除E3泛素连接酶Cop1 会减少巨噬细胞相关趋化因子的分泌，减少肿瘤巨噬细胞浸润，增强抗肿瘤免疫力，并加强免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）治疗癌症。CRISPR/Cas9技术介导实现基因敲除肽基丙基异构酶A （peptidylprolyl isomerase A，PPIA），有效提高了多发性骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感程度［12］。

设计的特异sgRNA 与非靶位点DNA 序列形成错配，导致基因位点发生非预期的突变，称为脱靶效应（off-target effects）。非靶位点的sgRNA 局部错配的形式有2 种：（1）脱靶DNA 序列与sgRNA 只出现碱基的错误匹配，长度一致；
（2）脱靶DNA序列与sgRNA的长度不同，通过DNA序列的插入或缺失使其出现碱基错配［13］。研究显示，脱靶不仅会降低基因组编辑效率，还会导致染色体的重新排列，甚至会破坏不完全匹配的基因［14］。除此之外，还可能会导致功能基因丧失活性［15］。

2.1 影响CRISPR/Cas9系统脱靶的因素

2.1.1sgRNA 对脱靶的影响 sgRNA 与靶序列的错误匹配是造成脱靶现象的关键因素。研究显示，在一定范围内，体内sgRNA质粒转染的相对浓度越低，靶点的专一性越高［16］。酵母双杂交实验研究显示［17］，短sgRNA序列与标准sgRNA序列相比，前者的脱靶率更低；
且脱靶出现的概率和sgRNA序列与靶基因sgRNA序列的同源程度呈正相关。研究表明，在不降低切割活性的基础上，将sgRNA 5’端的2 ～3个碱基截短，能够大大降低脱靶率［18］。综上表明，sgRNA本身序列、浓度、长度及其与靶基因的同源性在一定程度上决定CRISPR/Cas9系统的靶向性。

2.1.2PAM对脱靶的影响 PAM序列是区分靶序列与其他DNA序列的一段高度保守区域，其可以限制基因组的编辑［19］。在CRISPR/Cas9系统的基因编辑过程中，Cas1、2 蛋白和sgRNA-Cas9 复合体先后对PAM序列进行特异性识别［20］，最终精准获取目的基因。金黄色酿脓葡萄球菌Cas9蛋白（staphylococcus aureus， SaCas9）识别的PAM 区为NNGRRT，该系统用于体内基因组编辑，即表明使用较长的PAM 序列，潜在的脱靶位点少，脱靶出现的可能性小［21］。近来通过对sgRNA 的活性及特异性进行检测与评估，发现PAM 近端1 ～ 5 位碱基序列是更精准地决定sgRNA特异性的种子区域（seed sequence）［22］。综上所述，PAM自身序列、长度、邻近的种子区域等在一定程度上能够对脱靶产生影响。

2.1.3Cas9 对脱靶的影响 Cas9 自身结构、剪切活性、质粒转染浓度等在一定程度影响脱靶。野生型Cas9蛋白形成的双链断裂可致脱靶，通过对Cas9进行改造可提高切割靶基因的特异性。Cas9 的HNH结构域通过调控剪切活性，干预sgRNA与靶位点结合能力，进而影响脱靶效应。其中，Cas9 的剪切活性与错配碱基的位置分布、数量密切相关。紧邻PAM 序列的DNA-RNA 双链错误匹配会降低Cas9活性，此外发生两个或更多碱基的错配对降低Cas9活性的程度远高于单碱基错配［23］。研究显示，Cas9 蛋白能容忍sgRNA 与DNA 的错误匹配，由此推测，一定范围内，细胞内Cas9 质粒转染的相对浓度越低，靶点的专一性越高［24］。通过修饰Cas9自身结构，已形成多个高保真性Cas9 突变体，对脱靶的改进具有质的提升［20］。

2.1.4其他因素对脱靶的影响 Cas9与sgRNA作为CRISPR/Cas9 系统的重要组成部分，二者既可相对独立又可相互联合对脱靶产生影响。研究显示，体外Cas9/sgRNA 的丰度值过高，容易切割PAM 区域的非靶向位点，使sgRNA 错配发生的机率升高［25］。此外，标靶序列的CpG岛甲基化也会对脱靶产生影响，CpG 岛甲基化与基因沉默表达相关。研究表明，超过一定范围，随着甲基化程度增高，Cas9蛋白与标靶基因的亲和力降低，靶点结合的专一性降低，进而增加脱靶效应［26］。值得注意的是，转染细胞的类型也是影响脱靶的一个关键因素。通过质粒转染技术将外源基因导入斑马鱼胚胎细胞和小鼠体内［27］，其靶向突变率极高；
而通过质粒转染技术将外源基因导入人K562 细胞［28］，其脱靶率保持在较低水平，且CRISPR/Cas9 系统具有较高的活性。

2.2 CRISPR/Cas9系统脱靶效应的优化方法

2.2.1以sgRNA为基础的改进策略

2.2.1.1修饰sgRNA 研究证实，sgRNA 的基因编辑准确率和特异性同sgRNA种子区GC含量成正比，当GC 含量在40% ～ 60%时，不易发生脱靶；
当在sgRNA 的5’末端添上2 个G 碱基时，可降低脱靶事件的发生率［29］。Kocak等［30］将sgRNA 5"端设计延伸20个核苷酸，使其自身折叠形成发夹二级结构并插入到间隔上，发夹结构指导RNA（hairpin construction， hp-sgRNA）可以作为R 环形成的空间和能量屏障，阻断SpCas9 构象转变为活性脱靶核酶，导致Cas9 特异性的增加。死亡RNA 脱靶抑制（dead RNA off-target suppression， dOTS）方法中，脱靶位点可以通过协同使用dead-RNAs （dRNAs）来屏蔽活性Cas9-sgRNA 复合体，截短的引导RNA 直接与Cas9 结合但不切割。dRNAs 可以在保持对靶标编辑的同时，以最小的优化有效抑制大范围的脱靶［31］。

研究发现，对PAM 近端、远端的sgRNA 碱基序列进行调整可使目标位点DNA 发生精确断裂。如果PAM 远端第15 个碱基是胞嘧啶，可以提高sgRNA 的特异性；
对于PAM 近端sgRNA 序列来说，种子区第1 个碱基通常选择鸟嘌呤，因鸟嘌呤使sgRNA 有更大的折叠倾向，形成的结构更加稳定，脱靶出现减少［32］。

2.2.1.2截短sgRNA 序列 CRISPR/Cas9 的基因靶向性会受到sgRNA 序列长短的影响［33］。降低脱靶率最快捷简便的方法就是将sgRNA截短，但这一方法可能会导致特异性sgRNA 与靶点结合的效率降低。如果把常用的由20 个核苷酸组成的sgRNA引导序列截短2 ～ 3个核苷酸，则既能保证靶向结合位点的效率，还可使脱靶的发生比例降低［34］。

2.2.1.3采用RE-DSRNP 技术策略 RE-DSRNP（reporter RNA enriched dual-sgRNA/CRISPR/Cas9 ribo-nucleoproteins）的方法通过使用双sgRNA 结合报告RNA富集CRISPR/Cas9核糖核蛋白，最终生成精确编辑的供体细胞，以供基因组学和疾病研究［35］。RE-DSRNP 技术优势在于双sgRNA 精准靶向系统具有较高的编辑效率、较低的脱靶效应。研究发现，当使用RE-DSRNP 来生产带有野生型p53诱导的磷酸酶1 （WIP1）基因缺失的克隆猪时，在32头断奶克隆猪中，31头（97%）携带WIP1编辑，15头（47%）为设计的片段缺失的纯合子，使用该方法后没有检测到脱靶事件。

2.2.1.4采用Bi-PE 策略 新型编辑技术先导编辑（prime editing，PE）能直接支持小规模的靶向点突变、精准插入和删除，同时不会导致DNA 双链的断裂，但编辑效率较低。2022 年，四川大学姚少华团队［36］提出双向启动编辑（Bi-PE）策略，其在目前优化的先导编辑（PE）工具基础上进行改进，通过nick sgRNA 定位在prime editing guide RNA（pegRNA）的模板序列附近，并且将2 个引导RNA 工程化为pegRNA 以实现Bi-PE，大大提高靶向准确性和基因编辑的效率。

2.2.2以Cas9为基础的改进策略

2.2.2.1突变体Cas9 策略 Cas 蛋白有2 个核酸酶结构域RuvC和HNH，RuvC负责切割与sgRNA互补的DNA，HNH负责切割另一条DNA。当Cas活性位点H840A失活时，得到仅具有切割DNA的1条链能力的nCas9（Cas9 nickase）［37］；
当2 个活性位点D10A和H840A均失活时，得到无切割能力的dCas9（dead Cas9）［38］。融合dCas9 和野生型Fok I 核酸内切酶的功能结构域，得到融合蛋白dCas9-Fok I，由核酸内切酶Fok I 行使切割双链DNA 的作用，核酸内切酶Fok I 需要进行二聚化才发挥切割作用。融合蛋白d Cas9-Fok I 单体只有和2 个sgRNA 结合在一起时才有切割能力，进而形成正确的双链切口，降低脱靶［39］。

2.2.2.2SpCas9变体 普遍运用于基因编辑的化脓性链球菌Cas9 （streptococcus pyogenes， SpCas9）识别的PAM 序列为NGG。若将N 固定为一种核苷酸或将PAM 序列延长，均可则可减少Cas9 识别的目标序列，提高靶向专一性［40］。

2015 年，D1135V/R1335Q/T1337R（VQR）和D1135V/G1218R/R1335E/T1337R（VRER）等变体相继衍生。VQR-SpCas9 变体在位点分析结果中，耗尽了带有NGAN 的PAM 位。VRER-SpCas9 变体在定量分析增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）中，于NGCG PAM 上显示最高的活性［41］。这些变体的全基因组特异性更好，极大地保证了靶向效应的准确性。此外，有研究者使用噬菌体辅助连续进化系统（phage-assisted continuous evolution， PACE）得 到 了SpCas9 变 体xCas9，经过相关实验验证，其可识别更广泛的PAM序列（NG、GAA 和GAT 等），兼容性更广，一定程度上扩大了基因靶向范围，同时新的变体表现出更高的特异性［42］。研究人员筛选了一个在REC3域携带随机突变的SpCas9变体库，确定了既可以保证编辑效率同时具有较高编辑准确性的突变体，如HypaCas9。另外发现，通过结合4 个有益突变生成的evoCas9 变体的保真度超过野生型，其目标编辑效率与野生型保持一致。与HypaCas9 相比，evoCas9 的特异性更高，产生的脱靶位点更少［43］。通过变体对PAM 序列进行限定或拓展进而降低脱靶风险到目前为止仍在探索研究。

2.2.2.3SaCas9 变体 SaCas9 通常被用于进行体内的基因组编辑，但是野生型SaCas9在单核苷酸分辨率上有脱靶效应。研究发现，在不影响靶标效率的前提下，可设计具有高度特异性的全基因组活性的SaCas9 工程变体（SaCas9-HF）。在15 名受试者中，该变体几乎不会对目标基因位点发生偏离，并且在一些极易发生脱靶的序列位点处，SaCas9-HF与野生型相比其脱靶活性也显著降低。对该变体做进一步改变并命名为KKH-SaCas9，其具有更大的PAM识别范围，脱靶活动也显著减少［44］。利用定向筛选系统，研究者在人类细胞中鉴定出了增强保真度SaCas9（efSaCas9），可以有效地辨别单碱基对发生的不匹配情况，并进一步避免该情况的发生［45］。

2.2.2.4改变Cas9 蛋白的带电性 Slaymaker等［46］发现，改变Cas9 蛋白的氨基酸带电性，如把正电性氨基酸残基变为电中性，会减少与非靶向链的互补作用，降低脱靶率。

2.2.2.5终止Cas9 酶活性 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑可永久逆转病理性DNA突变，在完成治疗性DNA 修饰后需要终止Cas9 酶活性，避免潜在的非靶向编辑。

实验证明，用抗寡核苷酸可以关闭Cas9 活性，从而减少或防止非目标DNA编辑，开辟了一条通过Cas9 核糖核蛋白失活提高基因编辑安全性的途径［47］。在临床应用中，若只需要在一个组织中编辑目标基因，那么在非目标组织中预先给予抗寡核苷酸可防止非靶向效应。针对此问题，利用荧光偏振技术对SpCas9-PAM 的相互作用进行初步筛选分析，通过结构-活性关系确定了抑制SpCas9 的药效团为BRD0539，BRD0539 通过与NGG 竞争或结合到变构点来发挥作用，可以有效停止对非靶向基因的编辑［48］。通过以核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）形式传递Cas9和sgRNA限制Cas9活性的持续时间，减少脱靶突变效应［49］。

在噬菌体和质粒等遗传元件中存在抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR proteins， ACR），其中该蛋白家族的AcrIIA17 和AcrIIA18，也已被研究证实可以通过调节sgRNA来抑制Cas9活性［50］。

2.2.2.6开发Cas9同源蛋白 来自于不同细菌种类的Cas9 蛋白具有不同的识别PAM 序列的能力，所以如果改变Cas9蛋白的细菌来源，可以在一定程度上减少脱靶事件的发生。脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9 （neisseria meningitidis， Nm Cas9）识别的PAM序列为5’-NNNRRT-3’或5’-NNNNGMTT-3’［51］，由于PAM序列较长，Cas9识别PAM的特异性更高，出现脱靶的可能性减少。同样识别较长PAM 序列的还有嗜热链球菌Cas9（streptococcus thermophilus，St1Cas9）［52］、空 肠 弯 曲 杆 菌Cas9 （campylobacter jejuni， CjCas9）［53］。

2.2.3改进CRISPR/Cas9系统的递送方式 CRISPR/Cas9系统本身组件为大分子，需整合至细胞内发挥作用。目前体外递送技术有一定发展，如电穿孔［54］、脂质转染等［55］。许多体内递送系统正不断改进，如用由疏水尾的二硫键组成的生物可还原脂质纳米BAMEAO16B 输送［56］、质粒/病毒载体递送［57］、非病毒载体递送［58］、新型病毒载体递送［59］、结合质粒供体DNA 模板和Cas9-RNP 方法［60］、选择性响应加速基因递送系统（HPT-PFs）［61］、新型基因递送载体（CA3S2）［62］。最新开发的低脱靶效应的CRISPR /Cas9 质粒和模板DNA 传递系统-CRISPR/Cas9 复合聚乙烯亚胺磁性纳米颗粒（polyethyleniminemagnetic nanoparticles，PEI-MNPs），PEI-MNPs 有效提高基因编辑的安全性和实用性［63］。

2.2.4其他优化方法 （1）集成学习框架的提出。有研究者提出将一系列单一非目标预测工具与基因组注释联合应用，把多种组合进行比较，择出最优组合，最大限度提高对非目标活动的预测［64］。该研究协同工具进行CRISPR/Cas9脱靶预测以实现整体洞察和实际应用，对精准医学有重要研究价值。（2）利用高通量方法CHANGE-seq，用于在体外确定CRISPR/Cas9 核酸酶的全基因组活性，探究影响Cas9活性的靶向和非靶向序列的因素，预测非靶点活性，选择出高度特异的靶点，识别与非靶点突变相关的染色质特征，并测量人的遗传和变异对核酸酶活性的影响［65］。（3）应用去甲基化技术。表观遗传学相关的理念也可以用于降低脱靶率的发生。TET1 作为一种双加氧酶，可以帮助启动DNA 去甲基化。将TET1 催化结构域（TET1-CD）连接到已插入噬菌体MS2 RNA 的sgRNA2.0 系统，引导dCas9和MS2 菌噬菌体涂层蛋白来靶向特定基因组位点去甲基化，有效降低脱靶率［66］。（4）减少Cas9/sgRNA复合物的浓度。以质粒为工具转染细胞时，若直接减少sgRNA 用量或者改变所用的启动子种类来影响sgRNA 的转录，达到降低复合物浓度的目的，降低脱靶［67］。但需要通过实验确定合适的Cas9/sgRNA 浓度，尽可能避免复合物浓度的减少所带来的切割效率降低。

作为一种新颖的基因治疗法，CRISPR/Cas9 技术因精准高效、易于操作等优势，已逐渐成为具有前瞻性、创新性的基因组定点编辑技术，展现出强大的临床应用潜力。目前，CRISPR/Cas9 系统与多种技术结合，可实现对肿瘤等相关疾病的精准治疗。但是，明确和优化脱靶效应是当前解决临床应用的关键问题之一，同时也需重点关注CRISPR/Cas9系统的递送方式地改进、提高脱靶检测准确度的方法等。希望通过研究人员的不懈努力，CRISPR/Cas9 基因编辑技术将会不断优化，在医学等各领域发挥更加重要的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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