血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

韦悠，谢芝勋，邓显文，李小凤，谢志勤，范晴，张艳芳，黄娇玲，王盛

（广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

【研究意义】血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）感染会导致以高发病率和高死亡率为特征的心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）。该病毒自2015年起在我国山东、河南、湖北、湖南、广西、广东等家禽养殖大省（区）爆发，导致3～6周龄雏鸡14%～80%的死亡率（Guan et al.，2018；
张蕾等，2020）。因此，FAdV-4诊断技术的研究近年已成为热点。开展FAdV-4的Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备研究对建立快速灵敏的病毒检测方法具有重要的研究意义。【前人研究进展】Fiber-2为FAdV-4病毒粒子外壳表面往外伸出的“天线”状蛋白，为病毒与宿主细胞首要互作蛋白，具有特异性的抗原决定簇，可作为FAdV诊断的靶蛋白（Marek et al.，2012；
Kulanayake and Tikoo，2021；
Sohaimi and Hair-Bejo，2021）。研究表明，Fiber-2蛋白与宿主蛋白KPNA3/4互作会显著影响病毒对宿主的感染及致病力（段文丽，2018；
谢泉，2021）；
决定FAdV-4致病性之一的重要因素是Fiber-2蛋白，Fiber-2发生变化可引起病毒致病性的改变（Zhang et al.，2018）。Gupta等（2017）、Wang等（2018）通过动物试验证实，FAdV-4病毒颗粒结构蛋白中Fiber-2免疫原性最佳，可诱导产生中和抗体抵御腺病毒的感染，免疫蛋白50μg/羽时可达100%攻毒保护率。程增青等（2020）、刘建勋等（2020）利用大肠杆菌表达系统表达Fiber-2蛋白，通过攻毒保护试验发现可给予鸡只100%的保护。可见，Fiber-2可作为FAdV-4亚单位疫苗及检测试剂盒首选蛋白。王萍（2018）用FAdV-4以全病毒免疫小鼠后，以Fiber-2原核表达产物为筛选抗原研发单克隆抗体。刘娜（2018）亦用Fiber-2和Hexon蛋白筛选单克隆抗体并研制胶体金试纸。He等（2018）建立了以Fiber-2重组蛋白为基础的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，可准确、灵敏鉴定FAdV-4和监测其分子流行病学。【本研究切入点】优化密码子并截取Fiber-2蛋白抗原性集中的N端1～267 aa片段进行表达，可有效提高翻译效率及抗原性，目前未见相关研究报道。【拟解决的关键问题】按照大肠杆菌密码子偏好性，对FAdV-4编码的Fiber-2蛋白序列进行优化，并截取抗原性集中的N端1～267 aa片段，构建其蛋白颗粒作为免疫原制备单克隆抗体，将获得重组蛋白及特异性佳的单克隆抗体用于病毒检测试剂盒研发，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。

1.1 试验材料

Sp2/0细胞、LMH细胞、FAdV-4阳性鸡血清、pET-32a（+）载体、禽流感病毒（AIV）、鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和减蛋综合征病毒（EDS）由广西兽医研究所生物技术重点实验室保存提供；
BALB/c小鼠购自广西医科大学；
大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞和Trans8K DNA Marker购自全式金公司；
PrimeSTAR®HS DNA Polymerase、限制性内切酶EcoRⅤ、HindⅢ、DNA Ligation Kit（Mighty Mix）购自TaKaRa；
高效RIPA组织/细胞快速裂解液、苯甲基黄酰氟（PMSF）、溶菌酶、蛋白电泳预制胶（4%～15%）、彩虹180、245广谱蛋白Marker和考马斯亮蓝染色液购自Solarbio公司；
E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit、E.Z.N.A.®Plasmid Mini KitⅡ试剂盒购自Omega公司；
碱性磷酸酶（AP）标记山羊抗鸡IgG（H+L）购自碧云天生物技术有限公司；
弗氏不完全佐剂、弗氏佐剂、秋水仙素、HAT培养基、HT培养基和PEG4000购自Sigma公司；
胎牛血清购自Gibco公司；
HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司；
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG购自Seracare公司；
小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech公司。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因选取及引物设计用Thermo GeneArt在线工具GeneArt™GeneOptimizer™对FAdV-4-GX2019-010（MW439040）的Fiber-2基因序列进行密码子优化，由深圳华大基因科技有限公司合成序列。利用DNAStar 7.1中Protean对Fiber-2蛋白的氨基酸序列进行分析，综合考虑抗原性、亲水性及表面可及性，从Fiber-2基因序列1～801 bp进行截取，对应编码氨基酸序列为1～267 aa。应用Primer Premier 5.0设计Fiber-2基因引物，引物序列为F：5′-CCCGA TATCATGCTGCGTGCACCGAA-3′；
R：5′-CCCAAG CTTTTAGGTCACCGCCAGGGTAT-3′，下划线处分别为EcoRⅤ和HindⅢ酶切位点，委托深圳华大基因科技有限公司合成。

1.2.2 基因片段扩增及表达载体构建以优化后合成Fiber-2基因片段作为模板，利用PrimeSTAR®HS DNA Polymerase进行高保真扩增，扩增程序：98℃5 min；
98℃10 s，55℃5 s，72℃60 s，进行32个循环；
72℃10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收，将其连接至pGEX-20T载体从而获得重组载体，并利用EcoRⅤ和HindⅢ内切酶对其和pET-32a（+）空载体进行双酶切，将酶切后的目的片段与pET-32a（+）连接，然后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。培养12 h后，挑选白色、单个菌落扩大培养后进行双酶切鉴定及测序鉴定。

1.2.3 重组蛋白表达及可溶性鉴定挑取含测序对比序列正确的pET-32a（+）-Fiber-2重组质粒阳性菌，经含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基37℃摇床培养，待OD600nm约0.8时加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），继续培养2 h。取诱导后的菌泥加入含1%PMSF的细胞裂解液和5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min、冰浴10 min、超声裂解4 s后，用蛋白电泳预制胶（4%～15%）进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，检测重组蛋白表达情况。

将诱导后的菌泥用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，加入溶菌酶和PMSF混匀后，冰上超声裂解至溶液澄清，12000 r/min离心4 min，收集上清和沉淀，沉淀加入PBS重悬。分别取上清和重悬后的沉淀各100 μL，加入25μL 5×蛋白上样缓冲液后，煮沸10 min，冰浴10 min，13000 r/min离心2 min，用蛋白电泳预制胶（4%～15%）进行SDS-PAGE电泳，观察重组蛋白是否在上清或沉淀中表达。

1.2.4 重组蛋白纯化将含pET-32a（+）-Fiber-2的阳性菌扩大培养，诱导表达后12000 r/min离心10 min收集菌体，加入细菌裂解液（含PMSF和溶菌酶），漩涡振荡混匀，冰上超声裂解至菌液变清后，12000 r/min，4℃离心15 min，收集沉淀。将沉淀充分溶解于Binding Buffer中，加到预处理的Ni-Agarose Resin层析柱中结合20 min，依次按含25、50、75、100、125、150、175和200 mmol/L咪唑的Elution Buffer梯度冲洗柱子，然后对洗脱液用蛋白电泳预制胶（4%～15%）进行SDS-PAGE电泳检测并拍照观察纯化结果。

1.2.5 Western blotting鉴定将pET-32a（+）空载体和pET-32a（+）-Fiber-2表达蛋白用蛋白电泳预制胶（4%～15%）进行SDS-PAGE电泳（80 V，90 min）。不需染色直接进行半干转印：PDVF膜在甲醇中激活10 s，将滤纸2张、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和蛋白胶放于转膜液中浸泡10 min，从下到上按滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸整齐放置，设定程序：25 V，30 min，将重组蛋白转印至PVDF膜。转膜结束后用20 mL 5%脱脂奶37℃封闭4 h，用含Tween的Tris-HCl缓冲液（TBST）洗涤1次后加入2 mL 1∶200稀释FAdV-4阳性鸡血清，4℃过夜孵育。用1×TBST洗涤4次，加入2 mL 1∶500稀释的AP标记山羊抗鸡IgG（H+L），37℃孵育1 h。然后用TBST洗涤4次，加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑兰（BCIP/NBT）显色液，室温避光显色30 min后观察结果。

1.2.6 动物免疫及细胞融合选择9～11周龄的BALB/c小白鼠，将纯化后的蛋白（约5 mg/mL）与完全弗氏佐剂等体积混合乳化，按30～40μg/只分多点皮下注射。间隔2周使用不完全弗氏佐剂乳化蛋白后进行第2、第3次免疫，按30～40μg/只进行腹腔注射。第3次免疫后2周采小鼠血清测效价，当血清效价达1∶5000以上时可用于融合试验。融合前3 d注射无佐剂蛋白200μg/只作超强免疫。无菌取小鼠脾脏碾碎后用筛网过滤获得细胞悬液，计数后与状态良好的Sp2/0细胞按5∶1比例混合，在40℃的50%聚乙二醇4000（PEG4000）作用下进行细胞融合。

1.2.7 杂交瘤细胞筛选用含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的HAT培养基培养融合细胞。待融合后5～6 d观察标记有单细胞群落的细胞培养孔，在融合后12～14 d收集细胞培养上清液。使用200μL/孔FAdV-4病毒液（105TCID50/mL）作为包被底物、空白骨髓瘤细胞培养液作为阴性对照、免疫小鼠血清作为阳性对照建立ELISA，对融合细胞培养液进行检测。将OD450nm值为阳性的孔用有限稀释法连续进行3次单细胞亚克隆。亚克隆的细胞在培养10 d后均取细胞培养液进行ELISA检测。选取生长状态稳定、分泌抗体效价高且稳定的细胞株进行保存。

1.2.8 单克隆抗体生物学特性分析抗体分泌稳定性的分析：在液氮冷冻保存杂交瘤细胞后6个月复苏细胞进行连续传代，在传至5、10和15代时收获细胞上清液测定ELISA OD450nm值，用于评估细胞分泌抗体稳定性。腹水抗体效价检测：对BALB/c小白鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0.5 mL/只），7 d后收集培养的阳性杂交瘤细胞，用PBS稀释至106个/mL后注射入小鼠腹腔（0.5 mL/只），待小白鼠的腹腔明显增大时，用注射器收获腹水，然后测定腹水ELISA OD450nm值检测效价。采用秋水仙素裂解法检查染色体数目：将培养进入对数生长期的杂交瘤细胞加入秋水仙素（终浓度0.04 mg/mL），继续培养6 h，离心取细胞泥加入预热37℃的KCl溶液（0.075 mol/L）在37℃作用20 min后，加入固定液（含3/4甲醇及1/4冰醋酸）固定，将固定后的细胞滴在冰预后的载玻片上火焰固定，自然干燥，用姬姆萨染色后，油镜观察，进行50个细胞/样品的染色体计数，判断其稳定性。单克隆抗体亚型鉴定：取5株阳性杂交瘤克隆株的培养上清液，按照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的步骤判断其重链和轻链的抗体亚型。

1.2.9 单克隆抗体特异性检测将AIV、NDV、IBV、EDS和FAdV病毒作为包被抗原（0.1μg/孔），杂交瘤细胞培养液1000倍稀释作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG 5000倍稀释作为二抗进行ELISA OD450nm值测定，用于评估其特异性，同时设PBS为阴性对照、pET-32a（+）-Fiber-2为阳性对照。

1.2.1 0 单克隆抗体间接免疫荧光将LMH细胞在48孔板培养至80%～90%，接种FAdV-4病毒（105TCID50/mL）0.2 mL/孔，同时设立未感染的LMH细胞作为阴性对照。37℃吸附1 h后用PBS清洗2次，用细胞维持培养基继续培养24～30 h。弃去培养液，用预冷的甲醛（含3% H2O2）固定细胞后，将杂交瘤细胞培养液上清稀释1000倍为一抗作用1 h，再用FITC标记的羊抗鼠IgG（H+L）稀释2000倍为二抗作用1 h，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察检测结果。

2.1 密码子优化及目的基因选取结果

对FAdV-4的Fiber-2基因进行密码子优化（图1），使其更符合大肠杆菌原核表达的密码子偏好性。按照Fiber-2蛋白的理化特性选取图示区域为目的片段，大小约801 bp（图2）。

2.2 基因片段扩增及重组表达载体构建

对优化后的Fiber-2基因截短片段进行PCR扩增，PCR产物电泳检测结果显示，扩增获得单一条带约801 bp，与预期结果相符（图3）。pET-32a（+）-Fiber-2重组表达质粒用EcoRⅤ和HindⅢ进行双酶切鉴定，酶切产物用1.5%水平琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有2条条带，分别与pET-32a（+）载体和Fiber-2基因截短片段的长度符合（图4），表明插入pET-32a（+）载体的目的片段正确，即成功构建pET-32a（+）-Fiber-2重组表达质粒。

2.3 重组蛋白表达和可溶性鉴定结果

对含pET-32a（+）-Fiber-2重组表达质粒的阳性菌进行诱导表达，SDS-PAGE检测结果显示，以含pET-32a（+）空载体菌株为对照，含pET-32a（+）-Fiber-2重组表达质粒的阳性菌经IPTG诱导后产生一条特异性的蛋白条带，大小约67 kD，与预期结果相符（图5）。将诱导的菌液进行超声裂解，取全菌液、裂解后上清液和裂解后沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果发现Fiber-2截短重组蛋白主要存在于裂解破碎菌体后的沉淀中，大部分以包涵体形式表达（图6）。

2.4 重组蛋白纯化结果

将Fiber-2截短重组蛋白使用Ni-Agarose Resin层析柱通过包涵体纯化方式纯化后，大部分杂蛋白被去掉，得到了较纯的蛋白条带（图7）。

2.5 Western blotting鉴定结果

FAdV-4阳性血清与表达蛋白大约在67 kD处发生反应，而空载体对照此处无特异性条带，表明Fiber-2截短重组蛋白正确表达。

2.6 单克隆抗体生物学特性分析结果

抗体分泌稳定性分析结果（表1）显示，杂交瘤细胞冻存6个月后连续传15代，从ELISA检测结果来看，5株细胞抗体分泌均达1∶1600～1∶6400，稳定性良好。腹水抗体效价检测结果（表1）显示，5株杂交瘤细胞均能诱导小鼠产生高效价抗体，效价达1∶320000～1∶1280000。染色体数目形态及数目检查结果（表2）显示，5个瘤株均能观察到形态清晰，状态较一致的染色体，染色体数目为94～110条，且标准差（SD）为2.6～4.2，符合杂交瘤细胞特性。单克隆抗体亚型鉴定结果显示，2C2、4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链；
5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。

表1 细胞培养液上清及腹水抗体效价检测Table 1 Antibody titers detection of cell culture supernatant and ascites

表2 5株杂交瘤细胞的染色体形态及数目鉴定结果Table 2 Identification results on chromosomes of 5 MAb cell lines

2.7 单克隆抗体特异性检测结果

将2C2、4F6、5A5、6G10和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体与AIV、NDV、IBV、EDS、FAdV病毒进行ELISA检测，结果显示5株杂交瘤细胞分泌的抗体只与FAdV病毒产生良好反应，而与其他病毒无交叉反应，说明5株杂交瘤细胞分泌抗体具有良好的特异性。

2.8 单克隆抗体IFA检测结果

以5株杂交瘤细胞分泌的多克隆抗体作为一抗，与感染FAdV-4的LMH细胞进行IFA检测，经显微镜观察发现，在感染细胞中均产生明显的荧光反应，均为阳性。

与操作复杂、造价昂贵、蛋白产量低的真核表达系统相比，使用基于大肠杆菌的原核表达来生产

反应原蛋白步骤更简单、可操作性更强，易于检测试剂盒的商品化（Kaur et al.，2018）。但不同物种有着不同的密码子偏好性，若目的蛋白中含有大量大肠杆菌低频或稀有密码子会严重降低重组蛋白的表达水平，甚至会导致错配（蔡海莺等，2013；
杨云彭等，2019）。陈云雨等（2021）使用JAVA Condon Adaption Tool对SARS-CoV-2的Mpro基因进行序列优化，目的蛋白表达量提升至15 mg/L。本研究使用Thermo GeneArt在线工具GeneArtTMGeneOptimizer™对Fiber-2基因的密码子按照大肠杆菌偏好性进行优化后，将IPTG最佳诱导时间由原来的37℃8 h缩短为37℃2 h，且蛋白收获量相同。

目前国内已有Fiber-2蛋白可溶性表达的报道，如梅梅等（2019）、张婷（2021）利用昆虫细胞表达系统进行Fiber-2蛋白可溶性表达；
郭瑞珍等（2021）通过使用促溶标签的原核表达载体获得可溶性Fiber-2蛋白，具有良好的反应原性和免疫原性。本研究通过20℃低温诱导12 h获得可溶性的Fiber-2截短蛋白，但在试验过程中发现在4℃条件下包涵体蛋白较可溶性蛋白不易降解，便于使用Ni-Agarose Resin层析柱纯化，且通过与FAdV-4阳性血清进行WB检测发现，可溶性蛋白与包涵体蛋白反应原性相同，为构建易于保存运输的ELISA试剂盒良好包被底物，本研究采用了包涵体表达的试验方法。

杜春红等（2012）研究表明，杂交瘤细胞的染色体不稳定，同株各细胞染色体数量SD＞5.0时可能会导致抗体分泌能力的丧失。本研究获得的5株杂交瘤细胞，并用秋水仙素裂解检测染色体数目，结果发现染色体数目为94～110，SD为2.6～4.2，说明这些杂交瘤细胞为Sp2/0细胞（染色体数目为40）和小鼠脾细胞（染色体数目为62～72）的杂合体。在4次亚克隆筛选中杂交瘤细胞大小均匀一致、形态浑圆、生长速度稳定，细胞上清阳性率均为100%，在传至15代后分泌抗体效价稳定未降低；
通过IFA试验证实可与FAdV-4病毒结合，说明该抗体具有与病毒结合的构象表位，且已知其对应于Fiber-2蛋白N端1～267 aa片段，可用于进一步研究蛋白在宿主细胞中的分布定位和表达变化及胶体金等病毒检测试剂盒的研发。

制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。

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