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    2019-2020年福建省A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因特征分析

    时间：2023-01-27 13:45:07来源：百花范文网本文已影响人

    陈宏彬，鄢育青， 张炎华，林 琦，吴晶晶，修文琼

    流行性感冒(Influenza)简称流感，是流感病毒引起的一种急性发热性呼吸道传染病。流感病毒是RNA病毒，病毒颗粒的表面有两种形态不一、长度均为10～20 nm的糖蛋白突起，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Iveuramidinase,NA)，均具有抗原性。HA及NA易于发生变异，而且变异是各自独立的。HA是病毒的主要抗原,不仅与机体免疫密切相关,而且还是流感发生抗原性变异的分子基础。疫苗接种是预防流感病毒感染的最佳方法，但抗原性不同、分离株的多样性给疫苗开发带来持续挑战[1]。2009年5月23日福建省出现首例输入性甲型H1N1流感确诊病例，该病例分离毒株与北美流行株高度同源[2]。此后，A(H1N1)pdm09亚型在福建省流感占据了重要的一部分。流感病毒通过人际传播引起了世界大流行严重威胁人类健康，造成巨大经济负担。本研究通过分析2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的HA基因特征，了解病毒的进化与变异趋势，为制定流感流行防控措施提供参考。

    1.1 资料及标本来源 中国疾病预防控制信息系统采集日期2016年1月1日至2020年12月31日的福建省流感监测数据。毒株来源2016-2020年福建省流感网络监测流感样病例，犬肾传代细胞或鸡胚分离培养。2016-2019年选取不同时间地区各12株、2020年毒株数量较少仅4株，总共52株。

    1.2 病毒核酸的提取 天隆科技(苏州)有限公司病毒RNA提取试剂盒，按说明书操作提取病毒RNA。

    1.3 引物设计与合成 引物序列见表1，由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

    表1 A(H1N1)pdm09型流感病毒HA基因扩增引物Tab.1 HA gene amplification primers for the influenza A (H1N1) pdm09 virus

    1.4 RT-PCR扩增及测序 SuperScript III One-step RT PCR System with platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase (Invitrogen)试剂盒。反应程序：45 ℃ 60 min；
    94 ℃ 2 min；
    94 ℃ 30 s，44 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，5 cycles；
    94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，31 cycles；
    68 ℃ 7 min。产物测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

    1.5 序列分析及进化树 2016-2020年福建省流感毒株序列用CLC软件拼接。与WHO推荐的北半球流感疫苗株2016-2017：A/California/07/2009、2017-2018：A/Michigan/45/2015、2018-2019：A/Michigan/45/2015、2019-2020：A/Brisbane/02/2018、2020-2021：A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019和clade代表株(参考https://www.ecdc.europa.eu/en)以及GISAID或GenBank下载的国内不同年份不同省份毒株117株，国外各地不同年份不同地区毒株83株共266株进行多序列排列比对。MEGA5构建Maximum Likelihood进化树，JTT-model, Bootstrap Reps 为1 000。

    1.6 基因位点特征分析 福建省毒株与当年WHO推荐的北半球流感疫苗株对比分析抗原决定簇、受体结合位点差异。Net NGlyc 1.0 Server在线分析软件预测糖基化位点。

    2.1 2016-2020年福建省流感流行情况分析 2016-2020年福建省流感网络监测流感样病例原始标本PCR鉴定结果详见图1。2016-2020年福建省不同年份不同型别流感病例数相差较大。2020年福建省流感病例总数为5年来最低。福建省近5年来H1N1pdm09在每一年都有流行，在2018年病例数最多，在2020年最少。

    2.2 进化树分析 福建省52株与疫苗株4株以及国内不同年份不同省份毒株117株、国外各地不同年份不同地区毒株83株共266株进化树见图2。2016年福建省毒株分为2支，一支为6B，一支为6B.1。2017年毒株分布泛，所占分支多。2018年和2019年一部分毒株分支有交集，分支较多分散涉及6B.1A2、6B.1A3等分支，仍在6B.1分支内。2019年一部分毒株与2020年为6B.1A5A。相邻年份毒株分支会有一定重叠，每年份毒株不止一个分支，可见3个年份毒株在同一分支里。我省毒株与其他省份、国外毒株分布基本一致，但仍有个别不同。纵观进化树每年WHO推荐疫苗株基本与主流行毒株一致。

    2.3 抗原决定簇及受体结合位点 与A/California/07/2009(H1N1) 比较福建省毒株抗原决定簇变异位点[3]和受体结合位点[4](表2)。主要涉及到Sa抗原决定簇，并稳定遗传从2016年直至2020年。其次为Ca抗原决定簇、Sb抗原决定簇，并涉及到多个受体结合位点(Receptor binding site，Rbs)。Cb决定簇S74R位点在2016年均保守，变异首先出现在2017年的少数毒株(3/12)，而在2018-2020毒株27株只有2株没有这个位点变异。与A/California/07/2009相比福建省毒株(总共52株)在抗原决定簇和受体结合位点外仍有多数变异位点存在，如：P83S(52株)、S84N(50株)、D97N(52株)、I216T(50株)、A256T(51株)、K283E(52株)、I321V(50株)、E374K(52株)、S451N(52株)、E499K(52株)，这几个变异位点在福建省毒株及疫苗株几乎都存在。N129D、D187A/V、Q189E、N260D是2019年开始部分毒株出现，2020年毒株都有的变异位点。

    2.4 糖基化位点 2016年疫苗株为8个糖基化位点，福建省毒株有2株为8个糖基化位点，其余10株为9个。2017-2018年疫苗株为9个糖基化位点，2017、2018年福建省毒株各有1株为8个，其余11株各为9个。2019-2020年疫苗株及福建省毒株均为9个糖基化位点。在2017-2018年期间162糖基化位点由NQSY转变为NQTY。2018-2019年期间11糖基化位点有3株为NSTE，其余为NSTD。10、23、87、276、287、540糖基化位点未发生改变。481糖基化位点1株缺失，1株为NETY,54株为NGTY,差异较小。162糖基化位点变异较大，见表3。

    图2 2016-2020年福建省A型H1N1pdm09 流感病毒HA基因进化树Fig.2 Evolution of the HA gene of influenza A (H1N1) pdm09 virus in Fujian Province from 2016 to 2020

    表2 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09 流感病毒HA基因变异情况Tab.2 Variations in the HA gene in influenza A (H1N1) pdm09 in Fujian Province from 2016 to 2020

    表3 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09 流感病毒HA基因糖基化位点变异情况Tab.3 Variations in glycosylation sites of the HA gene of influenza A (H1N1) pdm09 virus in Fujian Province from 2016 to 2020

    流行性感冒是一种全球性的健康问题，在人类、猪和其他各种哺乳动物和禽类中引起很高的发病率和死亡率。临床上预防和治疗流感的手段主要有疫苗和抗流感药物。流感病毒具有极强的重组变异和抗原漂移能力，严重限制了流感疫苗的免疫保护作用。RNA病毒有可能在短时间内产生遗传变异。病毒的基因重组是导致高致死率的严重人类大流行的主要因素之一。非复制型疫苗引起的免疫反应主要针对流感病毒的血凝素成分[5]。

    2016年欧盟/欧洲经济区(EU/EEA)流感94%流行型别为A型[6]，2018-2019年EU/EEA最主要流行型别为A型，仅极少数为B型[7]，2020-2021年ED/EEA地区流感活跃度降低，主要型别为B型[8]。2016福建省A型/B型各占半数，2018-2019虽仍以A型主导，但B型数量也不少。2020年福建省流感各型别数量急剧下降(图1),主要由于为减少SARS-CoV-2传播而采取的各种公共卫生和社会措施(如停止全球旅行、口罩使用、保持距离、居家)的影响。美国流感活跃度在2020年3月下降，在2020年夏季期间处于历史低位，并在2020年10月至2021年5月期间保持低位[9]。因此对于不同地区疫苗株匹配度也会有差异。同样情况也存在于甲型 H3N2，有研究[10]表明H3N2的亚型存在多样性， 多种亚型共存且不同年份间的优势流行株存在差异。

    全球流感毒株在2016年开始发生较大转变，分支由6B转化为6B.1并演化至6B.1A5A。2019-2020年欧洲CDC(eCDC)报告A(H1N1)pdm09主要为6B.1A5A分支[11]，与福建省及其他省流行株所在分支相同，但仍有少数毒株不在此分支内。2009-2013年期间因6B/6B.1/6B.2感染而导致发生流感相关并发症肺炎、机械通气和急性呼吸窘迫综合征的风险较高，2015-2016几个欧洲国家报告了高危群体和健康青年中大量的严重病例和结果[12]。不同年龄组在大流行病毒时暴露的免疫史可能是一个因素，原始抗原原罪的概念为不寻常的死亡模式提供了解释,年轻人肺部的细胞因子风暴的出现或消失也可能与此有关[13]。流感不同型别交叉复杂的流行情况使防控难度增加。

    5年来，福建省H1N1pdm 09 在多个抗原决定簇及受体结合位点，糖基化位点均有发生改变，并且在其他一些非抗原决定簇位点也发生较多改变。福建省毒株变异位点S162N是抗原决定簇也是糖基化位点。复合功能位点的改变必然对毒株毒力产生较大影响。HA糖基化位点的增减及位置变化，HA上糖链结构、数量的变化以及受体结合位点附近糖链的修饰等不仅对病毒的增殖、毒力产生影响，还会影响病毒与宿主细胞受体的结合能力等[14]。近年来，基于表位选择的多表位疫苗受到越来越多的研究,为了避免对疫苗效果的不合理预测，必须从分子和细胞层面进行多阶段生物信息学分析[15]。福建省在其他一些非抗原决定簇位点也发生较多改变。对于抗原决定簇外位点也有可能协同病毒表面的不同位点一起产生不同的结合力影响与抗体或体内其他细胞因子的结合，如涉及到一些B细胞、CTL、CD4T细胞上的表位[15]。

    2009-2014年福建省随着时间的推移HA 基因进化树逐渐形成6个分支，在同一年份里也有毒株位于不同的分支内[16]。在甲型H1N1流感期间，pdm09演化支6B/6B.1/6B.1A5A的感染严重程度增加A(H1N1)pdm09病毒的抗原变化、宿主的免疫应答、环境因素需要进一步调查。鉴于疫苗的有效期、人群的低接种率，国际贸易人和物品流通增强、国家人口基数较大需加强对流感的监测及功能研究以预防和控制疾病传染。根据进化树时间分布病毒流行株具有遗传多样性，单一年份疫苗株的有效性值得推敲。对于没有每年注射流感疫苗的人来说，预防感染效果可能达不到。

    流感病毒真正的转录复制过程还有待进一步研究，理论和观察到的实验现象之间并不完全相符[17]。目前流感疫苗的生产还是以鸡胚苗为主,问题仍然在于候选疫苗株的筛选方面，认为应在鸡胚苗的基础上改善季节性流感疫苗疫苗株的筛选[18]。本文分析2016-2020年间福建省H1N1pdm 09 毒株HA 基因的变异情况，并了解福建省与其他省份和全球范围内流感时间和空间上的分布差异，为我们更准确地了解流感病毒的传播周期、范围和以此为基础的抗流感药物的研发奠定理论基础。

    利益冲突：无

    引用本文格式：陈宏彬，鄢育青，张炎华，等. 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因特征分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：988-995. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.144

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